穿心莲內酯通过激活AMPK抑制炎症反应的机制研究
发布时间：2021-03-31 06:24
目的:穿心莲内酯（Andrographolide）是从常用的中药穿心莲中提取的二萜内酯类化合物,具有广泛的生物活性。为了更贴近于临床,起到老药新用的目的,本课题拟通过对穿心莲内酯抗炎活性及作用机制的更深入研究,发现新的抗炎靶点,并为抗炎药物的开发提供科学依据。方法:采用MTT法比较不同浓度的穿心莲内酯对细胞存活率的影响。使用穿心莲内酯预处理巨噬细胞后,再用LPS诱导炎症反应,运用Griess法和Western Blot（WB）实验检测一氧化氮（NO）及其相关蛋白i NOS和COX-2表达水平;采用ELISA和RT-PCR法检测细胞因子的产生量和分泌量;采用WB实验检测NF-?B,MAPK以及上游信号通路蛋白表达水平;运用细胞核质分离技术和免疫荧光实验检测穿NF-?B和AP-1核转位情况。利用细胞内信号阵列实验和WB实验检测穿心莲内酯对LPS诱导的RAW264.7细胞中与炎症、代谢、凋亡等相关信号通路上的一些特异性标志蛋白的作用;选用AMPK激活剂AICAR和抑制剂Compound C与穿心莲内酯对AMPK/NF-?B/MAPK信号通路中蛋白水平的影响相比较。运用si RNA转染方法AM...
【文章来源】：上海中医药大学上海市
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
穿心莲内酯对细胞存活率的影响
上海中医药大学博士学位论文14RAW264.7和BMDM1h后，加入LPS刺激24h，然后，通过NO实验（Griess法）检测细胞上清中的NO浓度，计算穿心莲内酯对NO产生的抑制率。结果如图2A和C所示，在RAW264.7和BMDM细胞中与DMSO组相比，穿心莲内酯能成浓度依赖性地抑制LPS诱导的NO的产生，且在RAW264.7细胞10μM具有显著性差异。其次，采用免疫印迹分析法(WB)检测了穿心莲内酯对NO生成相关的iNOS和COX-2蛋白表达水平的影响。结果如图2B和D，穿心莲内酯可以显著地抑制LPS诱导的RAW264.7和BMDM细胞中iNOS和COX-2蛋白的表达水平，且具有浓度依赖性，结果表明穿心莲内酯能够抑制LPS诱导的巨噬细胞的炎症反应。图2.穿心莲内酯对NO的产生和相关蛋白的表达的作用穿心莲内酯处理RAW264.7(A,B)和BMDM(C,D)1h后，加入LPS刺激24h，然后取上清检测NO浓度(A,C),并取细胞蛋白检测iNOS和COX-2蛋白表达(B,D)。采用ImageJ软件定量蛋白条带进行灰度分析，β-actin作为内参蛋白。所有结果三次独立重复实验，以“平均值(mean)±标准差(SEM)”表示。##P<0.01，###P<0.001表示该组与空白对照组相比有统计学意义，***P<0.001表示该组与LPS组或LPS+IFN-组相比有统计学意义。Fig2.EffectsofAndroonNOproductionanditsrelatedproteinexpressionRAW264.7cells(A,B)andBMDMs(C,D)werepretreatedwithAndrofor1h,followedbytreatmentwithLPS(1μg/mL)for24h.Afterthentheculturesupernatant
上海中医药大学博士学位论文16图3.穿心莲内酯对LPS诱导的促炎细胞因子的影响不同浓度的穿心莲内酯(1、10M)加入RAW264.7细胞中作用1h，LPS刺激12h后，通过ELISA实验检测细胞培养上清中IL-6(A)、TNF-(C)和IL-1(E)的浓度；LPS作用6h后，用RT-PCR技术检测IL-6(B)、TNF-(D)和IL-1(F)的mRNA变化。所有结果为三次独立重复实验，以“平均值(mean)±标准差(SEM)”表示。##P<0.01，###P<0.001表示该组与空白对照组相比有统计学意义，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001表示该组与LPS组相比有统计学意义。Fig3.EffectsofAndroonLPS-inducedproinflammatorycytokinesRAW264.7cellswerepretreatedwithAndro(1,10μM)for1h,followedbytreatmentwithLPSfor6h(forPCR)andfor12h(forELISA).Theproduction(A,C,E)ofIL-6,TNF-andIL-1weremeasuredbyELISA,themRNAlevels(B,D,F)ofthemweredetectedbyPCR.Allresultsareshownasmean±SEMofthreeindependentexperiments.##P<0.01，###P<0.001,comparedtonon-treatedgroup.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,comparedtoLPS-treatedgroup.3.4穿心莲内酯抑制NF-B信号通路的激活NF-B是细胞中重要的转录调节因子，通过刺激因子被活化以后，参与产生多种炎性细胞因子。由LPS等多种刺激因素刺激后，IKK复合物(IKK/)通过磷酸化被激活，然后磷酸化IB导致IB蛋白被泛素化和溶酶体降解，NF-B被释放出来[49,50]。我们采用WB法检测了穿心莲内酯在LPS诱导的巨噬细胞中对NF-B信号通路的影响。如图4所示，穿心莲内酯能够抑制了IKK/和IB的磷酸化水平，同时抑制IB的降解，且其作用效果呈浓度依赖性。同时在RAW264.7、U937和BMDM细胞3种不同巨噬细胞上作用结果一致。结果表明穿心莲内酯能够抑制LPS诱导的巨噬细胞中NF-B通路的激活。
本文编号：3110965
【文章来源】：上海中医药大学上海市
【文章页数】：118 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
穿心莲内酯对细胞存活率的影响
上海中医药大学博士学位论文14RAW264.7和BMDM1h后，加入LPS刺激24h，然后，通过NO实验（Griess法）检测细胞上清中的NO浓度，计算穿心莲内酯对NO产生的抑制率。结果如图2A和C所示，在RAW264.7和BMDM细胞中与DMSO组相比，穿心莲内酯能成浓度依赖性地抑制LPS诱导的NO的产生，且在RAW264.7细胞10μM具有显著性差异。其次，采用免疫印迹分析法(WB)检测了穿心莲内酯对NO生成相关的iNOS和COX-2蛋白表达水平的影响。结果如图2B和D，穿心莲内酯可以显著地抑制LPS诱导的RAW264.7和BMDM细胞中iNOS和COX-2蛋白的表达水平，且具有浓度依赖性，结果表明穿心莲内酯能够抑制LPS诱导的巨噬细胞的炎症反应。图2.穿心莲内酯对NO的产生和相关蛋白的表达的作用穿心莲内酯处理RAW264.7(A,B)和BMDM(C,D)1h后，加入LPS刺激24h，然后取上清检测NO浓度(A,C),并取细胞蛋白检测iNOS和COX-2蛋白表达(B,D)。采用ImageJ软件定量蛋白条带进行灰度分析，β-actin作为内参蛋白。所有结果三次独立重复实验，以“平均值(mean)±标准差(SEM)”表示。##P<0.01，###P<0.001表示该组与空白对照组相比有统计学意义，***P<0.001表示该组与LPS组或LPS+IFN-组相比有统计学意义。Fig2.EffectsofAndroonNOproductionanditsrelatedproteinexpressionRAW264.7cells(A,B)andBMDMs(C,D)werepretreatedwithAndrofor1h,followedbytreatmentwithLPS(1μg/mL)for24h.Afterthentheculturesupernatant
上海中医药大学博士学位论文16图3.穿心莲内酯对LPS诱导的促炎细胞因子的影响不同浓度的穿心莲内酯(1、10M)加入RAW264.7细胞中作用1h，LPS刺激12h后，通过ELISA实验检测细胞培养上清中IL-6(A)、TNF-(C)和IL-1(E)的浓度；LPS作用6h后，用RT-PCR技术检测IL-6(B)、TNF-(D)和IL-1(F)的mRNA变化。所有结果为三次独立重复实验，以“平均值(mean)±标准差(SEM)”表示。##P<0.01，###P<0.001表示该组与空白对照组相比有统计学意义，*P<0.05、**P<0.01和***P<0.001表示该组与LPS组相比有统计学意义。Fig3.EffectsofAndroonLPS-inducedproinflammatorycytokinesRAW264.7cellswerepretreatedwithAndro(1,10μM)for1h,followedbytreatmentwithLPSfor6h(forPCR)andfor12h(forELISA).Theproduction(A,C,E)ofIL-6,TNF-andIL-1weremeasuredbyELISA,themRNAlevels(B,D,F)ofthemweredetectedbyPCR.Allresultsareshownasmean±SEMofthreeindependentexperiments.##P<0.01，###P<0.001,comparedtonon-treatedgroup.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,comparedtoLPS-treatedgroup.3.4穿心莲内酯抑制NF-B信号通路的激活NF-B是细胞中重要的转录调节因子，通过刺激因子被活化以后，参与产生多种炎性细胞因子。由LPS等多种刺激因素刺激后，IKK复合物(IKK/)通过磷酸化被激活，然后磷酸化IB导致IB蛋白被泛素化和溶酶体降解，NF-B被释放出来[49,50]。我们采用WB法检测了穿心莲内酯在LPS诱导的巨噬细胞中对NF-B信号通路的影响。如图4所示，穿心莲内酯能够抑制了IKK/和IB的磷酸化水平，同时抑制IB的降解，且其作用效果呈浓度依赖性。同时在RAW264.7、U937和BMDM细胞3种不同巨噬细胞上作用结果一致。结果表明穿心莲内酯能够抑制LPS诱导的巨噬细胞中NF-B通路的激活。
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