胶质瘤中GLUT3基因异常表达的意义及其相关调控机制

发布时间：2017-04-18 09:06

  本文关键词：胶质瘤中GLUT3基因异常表达的意义及其相关调控机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分：胶质瘤中GLUT3的表达及其意义研究背景：胶质瘤起源于神经胶质细胞。胶质瘤是常见的神经上皮肿瘤之一,包括星形细胞肿瘤,少突胶质细胞肿瘤,混合性胶质细胞肿瘤和室管膜肿瘤。星形细胞瘤是胶质瘤中最常见者,世界卫生组织(World Health Organization, WHO)根据其生物学行为将其分为Ⅰ～Ⅳ级。Ⅰ级：纤维型星形细胞瘤；Ⅱ级：低度恶性星形细胞瘤；Ⅲ级：间变型星形细胞瘤；Ⅳ级：多形性胶质母细胞瘤。恶性胶质瘤(malignant glioma, MG)主要包括Ⅲ级及Ⅳ级胶质瘤,约占到颅内原发恶性肿瘤的80%。由于胶质瘤具有侵袭性生长的生物学特性以及其生长于脑或脊髓,生长部位部位特殊,通常难以手术完全切除。血脑屏障的存在,阻碍了大部分化疗药物进入脑组织内,从而化疗也无法发挥其应有的作用。放疗虽然是各种类型胶质瘤常用的辅助治疗方法,也只能在一定程度上延缓肿瘤的复发。目前即使采用手术+放疗+化疗等综合治疗手段,其预后也仍然相当不乐观。MG的中位生存期只有12-15个月,总体的五年生存率不足6%。因此探寻新的有效的治疗方法是十分有必要的。这促使我们必须深入开展对该疾病发生发展的机理、尤其是分子机理的研究,以寻找到更为有效的治疗靶点。葡萄糖是大部分真核细胞的主要能量底物。水溶性的葡萄糖不能自由通过脂质生物质膜。葡萄糖的跨膜转运进入细胞是葡萄糖参与代谢的关键限速步骤。葡萄糖的跨膜转运必须由一类称之为葡萄糖转运体的蛋白家族协助转运。这一家族目前已经发现的成员有14个。按照转运体之间序列结构的相似性划分,该蛋白家族可以划分为三个亚家族：家族1 (GLUTs 1-4,14);家族2 (GLUTs 5, 7,9, and 11);与家族3 (GLUTs 6,8,10,12, and HMIT)。按照葡萄糖转运过程中钠离子依赖与否,葡萄糖转运体家族成员又可以分成钠离子依赖型与非钠离子依赖型两大类。钠离子依赖性转运体必须顺钠离子与葡萄糖浓度梯度转运钠离子与葡萄糖,而非钠离子型可以逆葡萄糖浓度主动摄取葡糖糖。钠离子依赖性转运体主要表达在小肠的吸收上皮,与日常从饮食中摄取葡萄糖有关。此类转运体还表达在肾脏上,参与葡萄糖的重吸收。非钠离子依赖型转运体可以表达在绝大多数细胞上。这类转运体的表达具有一定的组织特异性。红细胞主要表达GLUT1,肝脏主要表达GLUT2,肌肉和脂肪组织主要表达GLUT4。在脑内这两类转运体均有表达,只是表达的位置、转运能力、组织特异性有所不同。GLUT1在脑内有两种形式：糖基化程度高的GLUT1主要表达在脑血管壁上负责葡萄糖跨血脑屏障转运,糖基化程度低的GLUT1主要分布于星型胶质细胞的尾足与胞体上。GLUT2主要表达在下丘脑的神经元上,是一个葡萄糖感受器,具有食物摄入调节功能。在下丘脑神经元上GLUT2被认为可以调节突触活性以及神经递质释放功能。GLUT3是大脑内含量最多的转运体,其转运能力大约为GLUT1的5倍,主要分布于神经元上,尤其是轴突与树突上。GLUT3的分布密度与局部皮层葡萄糖消耗量相吻合。GLUT5是主要的果糖转运体,在脑内GLUT5是小胶质细胞上唯一的己糖转运体,并不分布于神经元上。上述生理分布模式在病理状态下会出现改变。在脑缺血缺氧过程早期中,GLUT3会出现增高,可以增加神经元的葡萄糖摄取,提高神经元的缺血缺氧耐受能力。用可以表达人的GLUT1与GLUT3的爪蟾卵实验,将其置于低渗液中可以发现GLUT3的表达量呈指数形式增长。糖尿病大鼠可以引起大脑皮层中GLUT3的表达增加。原代培养的大鼠神经元给予葡萄糖剥夺48h,也可以使GLUT3 mRNA增加4倍。在生理条件下,GLUT3蛋白在胶质细胞上难以检出,但是随着胶质瘤细胞的恶变,葡萄糖转运体3在胶质瘤中的表达明显升高,且与其病理分级呈现显著的正相关。那么GLUT3在胶质瘤中异常表达具有什么意义?目的：首先通过免疫组化技术检测不同级别胶质瘤标本中的GLUT3以及Ki-67表达情况,明确胶质瘤在演进过程中GLUT3表达量与肿瘤细胞增殖情况的关系。再用RNA干扰技术抑制胶质瘤中GLUT3表达,观察由此对胶质瘤细胞生长特性的改变。由此探明GLUT3在恶性胶质瘤中异常表达意义。(1).免疫组化方法检测胶质瘤甲醛固定石蜡包埋标本中GLUT3, Ki-67的表达情况。方法：1)收集胶质瘤WHO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级标本,每级5例。2)用免疫组化方法检测标本中GLUT3、Ki-67蛋白的表达量3)统计方法：应用SPSS 17.0软件进行统计分析。标本中GLUT3(或Ki-67)蛋白的表达量以每100个细胞中GLUT3(或Ki-67)蛋白阳性表达细胞数计算,并以均数±标准差(X±S)方式表示,所有数据均为三次或以上重复试验结果。两组样本之间均数比较采用两独立样本t检验加以分析；多组均数间比较：方差齐同时整体比较采用One-way ANOVA,组间两两比较采用LSD法；方差不齐时整体比较采用welch检验,组间两两比较采用Tamhane's检验。GLUT3与Ki-67蛋白的表达量的相关性用Spearman相关方法加以分析。检验水准设为口=0.05。结果：1)随着胶质瘤病理级别的增高,样本中GLUT3的表达阳性率呈现逐级上升趋势分别为：Ⅰ级：0.900±0.909%, Ⅱ级：13.420±3.653%,Ⅲ级：64.280±8.094%,Ⅳ级：93.340±5.212%,经方差齐性检验,得levene统计量F=51.561,P0.001,说明组间方差不齐,采用welch法行整体分析,welch统计量为6016.194,P0.001,组间两两比较采用Tamhane's方法,各组间比较P值均小于0.001,差异具有统计学意义。2)随着胶质瘤病理级别的增高,样本中Ki-67的表达阳性率呈现逐级上升趋势分别为：Ⅰ级：0.600±0.833%, Ⅱ级：11.140±4.291%,Ⅲ级：20.560±3.759%,Ⅳ级：31.500±4.896%,经方差齐性检验,得levene统计量F=17.639,P0.001,说明组间方差不齐,采用welch法行整体分析,welch统计量为1106.416, P0.001,组间两两比较采用Tamhane's方法,各组间比较P值均小于0.001,差异具有统计学意义。3)在肿瘤内部快速生长区中的GLUT3与Ki-67表达量均高于慢速生长区(GLUT3:93.340±5.212％/53.267±6.341%, t=-23.963, p0.001; Ki-67: 32.333±6.562% /21.333±5.158%, t=-7.224, P0.001),差异具有统计学意义。4)样本中GLUT3的表达阳性率与Ki-67的表达阳性率呈呈正相关(spearman,rs=0.928,P0.001)。(2)抑制GLUT3表达对胶质瘤生长特性的影响方法：1)构建GLUT3病毒干扰载体,包装GLUT3干扰病毒颗粒Lv-GLUT3;2)检验病毒Lv-GLUT3沉默GLUT3表达的效果；3)用MTT实验方法检测Lv-GLUT3感染胶质瘤细胞株U251,抑制GLUT3表达后胶质瘤细胞增殖速度的改变4)用伤口愈合实验方法检测Lv-GLUT3感染胶质瘤细胞株U251,抑制GLUT3表达后胶质瘤细胞迁移能力的改变5)用transwell实验方法检测Lv-GLUT3感染胶质瘤细胞株U251,抑制GLUT3表达后胶质瘤细胞侵袭能力的改变6)用流式细胞术方法检测Lv-GLUT3感染胶质瘤细胞株U251,抑制GLUT3表达后肿瘤细胞凋亡情况的改变7)统计学方法：使用SPSS 17.0分析,计量资料用均数±标准差(X±s)表示,所有数据均为三次或三次以上重复试验所得结果。对所测结果进行正态性检验以及方差齐性检验,正态分布数据两组间均数比较采用独立样本t检验,三组或三组以上均数比较采用方差分析,其中MTT实验结果与伤口愈合实验结果采用重复测量方差分析方法进行分析。检验水准设为α=0.05,P0.05认定为差异具有统计学意义。结果：1)所构建的GLUT3病毒干扰载体Lv-GLUT3,可以高效的感染胶质瘤U251细胞。与感染阴性对照病毒颗粒Lv-NC组相比,感染Lv-GLUT3后可以使胶质瘤细胞中GLUT3-mRNA的相对表达量下降(0.0000615±0.0000202/0.000647±0.000237,t=7.383,P0.001)以及GLUT3蛋白的相对表达量下降(0.108±0.0159/0.364±0.0444,t=16.267,P0.001)。与感染阴性对照病毒颗粒Lv-NC组相比,感染Lv-GLUT3后可以明显抑制胶质瘤细胞中葡萄糖摄取量下降,反映在细胞培养留在液中的葡萄糖含量较对照组增高(0D505：0.532±0.0308/0.449±0.0322,t=-5.619,P0.001),差异具有统计学意义。2)MTT检测结果采用重复测量方差分析方法加以分析,mauchly的W=0.758,P=0.125,满足球形度检验,时间主效应F=1734.375,P0.001,时间与组别的交互效应检测F=70.883,P0.001,处理组间比较有差别(F=800.730,P0.001)。与感染阴性对照病毒Lv-NC组相比,感染Lv-GLUT3后的48 h、72 h、96 h等时间点上,肿瘤细胞生长速度慢于对照组,分别为：48h(0D490：0.780±0.0257/0.859±0.0157),72h(0D490：1.018±0.00677/1.206±0.0165),96h(0D490：0.929±0.0115/1.022±0.00387)。3)伤口愈合实验结果采用重复测量方差分析方法加以分析,mauchly的W=0.930,P=0.304,满足球形度检验,时间主效应F=647.000,P0.001,时间与组别效应F=23.164,P0.001.处理组间比较有差别(F=228.343,P0.001)。与感染阴性对照病毒Lv-NC组相比,感染病毒Lv-GLUT3后肿瘤细胞在12 h、24 h、 36 h等时间点上,伤口愈合能力降低,伤口未愈合面积比例分别为：12 h(0.779±0.0884/0.515±0.0721),24 h(0.565±0.121/0.211±0.0305),36 h(0.186±0.0744/0.0345±0.0386)。4) Transwell实验结果显示：与感染阴性对照病毒Lv-NC组相比,感染病毒Lv-GLUT3后胶质瘤细胞可以侵透基质膜到达下室的细胞数减少(14.400±3.851/67.267±10.053,经两独立样本t检验得t=19.019,P0.001),差异具有统计学意义。5)流式细胞术检测结果显示,与感染阴性对照病毒Lv-NC组相比,感染病毒Lv-GLUT3后反映细胞凋亡的标志物--磷脂酰丝氨酸阳性细胞比率增高(0.133±0.00290/0.0777±0.00630,经两独立样本t检验得t=23.757,P0.001),差异具有统计学意义,提示感染Lv-GLUT3后胶质瘤细胞凋亡数增多。结论：1、GLUT3在胶质瘤中出现异常表达,并且随着肿瘤级别增高而增高,在肿瘤内部生长快速区域表达量高于生长慢速区域,GLUT3表达分布与反映细胞增殖标志物Ki-67表达分布一致,说明GLUT3的表达与细胞增殖速度情况平行。2、在胶质瘤中抑制GLUT3表达可以抑制胶质瘤细胞的增值速度,降低胶质瘤细胞的迁移侵袭能力,并促进肿瘤细胞的凋亡。第二部分 转录因子SP1参与胶质瘤中GLUT3异常表达的转录调控研究背景：在恶性胶质瘤中存在着GLUT3 mRNA的过度表达,这提示GLUT3基因转录活性的升高。基因的转录是指是以DNA单链为模板,在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。这一过程受到严密的调控。基因的转录调控主要由一类被称为转录因子的蛋白(反式作用因子)与基因附近(通常在基因上游)的非编码区内特定DNA模块(顺式作用元件)结合,起到激活或者抑制基因表达的作用。因此基因的转录调控主要涉及到两大类因素：反式作用因子与顺式作用元件。就基因序列而言,必须存在转录因子的潜在结合位点,并且这些潜在结合位点没有受到甲基化、乙酰化等修饰,可以被转录因子结合。就转录因子而言,典型的转录因子在结构上具有DNA结合域,可以识别结合特定的DNA序列。同一类转录因子的结合位点有很高的序列相似性,通常为6-20bp的一段短序列。转录因子的潜在结合位点可以通过一些生物信息学软件加以测算寻找。SP1是第一个确定的转录因子,属于Spl/Kruppel样转录因子家族。SP1在结构上具有锌指结构,可以通过锌指结构特异性地结合到DNA上富含GC的区域上,SP1识别的DNA序列为5'-(G/T)GGGCGG(G/A) (G/A) (C/T)-3'. Spl既是正常生长发育所必须,也对多种肿瘤包括胶质瘤发挥着重要影响。我们用TFsearch、 TESS等软件对GLUT3启动子的DNA结构进行的分析发现这一区域人、大鼠、小鼠具有高度同源性,它们都具有3个Spl的结合域。人的SP1结合位点分别位于GGGGCGTGGTGGCG GGCG (score,94.5), GGGGCGGGGGCGGGGG (score,91.8), GGGGGGTGGGGTGGGGTGGGG (score,90.4) [29]。这提示Sp1有可能通过与这些位点的结合而发挥转录调控功能。在小鼠和大鼠的神经元中Sp1可与启动子的顺式作用原件结合而降低GLUT3的表达。而在骨骼肌细胞中进行的实验则显示Sp1可以与三个结合位点中一个相结合,并促进(3LUT3的转录。上述这些发现一方面证实了Sp1确实参与了GLUT3基因的转录调控,另一方面又显示SP1对GLUT3的调控存在着组织特异性。Guan H等报道,在222例胶质瘤标本中58.6%的标本中出现了SP1的高表达,并且SP1的表达量与胶质瘤的WHO分级呈正相关。那么在胶质瘤中SP1的异常表达与GLUT3的表达之间有何关系?目的：通过分析克隆人GLUT3基因的启动子,构建SP1结合位点野生型与突变型GLUT3基因启动子报告基因载体以及SP1真核表达载体,观察转染SP1真核表达载体上调SP1表达对GLUT3基因的表达以及GLUT3基因启动子活性的影响,再通过染色质免疫共沉淀技术观察在细胞内SP1与GLUT3基因启动子区的结合关系。方法：1)构建SP1真核表达载体pIRES2-ZsGreenl-SP1、培养U251细胞,分组分别转染pIRES2-ZsGreenl-SP1、空质粒pIRES2-ZsGreen1、用RT-PCR检测SP1、GLUT3、GAPDH的mRNA表达情况,分析SP1表达量及GLUT3表达量之间的关系。用免疫印迹方法检测SP1、GLUT3、GAPDH的蛋白表达情况,分析SP1表达量及GLUT3表达量之间的关系。2)分析人GLUT3基因结构,扩增出GLUT3基因启动子区,并将其定向克隆到萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建出SP1结合位点野生型萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3-wt.将pGL3-GLUT3-wt以及空质粒pGL3-basic分别与内参质粒pRL-TK共转染入胶质瘤细胞U251中,用双荧光素酶报告基因检测系统检测重组质粒pGL3-GLUT3-wt中插入片段的启动子活性。3)分析GLUT3基因启动子区内转录因子SP1的潜在结合位点,用定点突变的方法构建SP1结合位点突变型萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-GLUT3-mut。4)培养胶质瘤细胞,分组转染pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1、 PGL3-GLUT3-mut+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1 以及 pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK +pIRES2-ZsGreenl培养后用双荧光素酶报告基因检测系统检测三组细胞的启动子活性,观察SP1结合位点在SP1上调GLUT3基因启动子活性中的作用。5)培养胶质瘤细胞,甲醛固定,超声打碎DNA后,用SPl抗体做染色质免疫共沉淀,阳性对照为细胞裂解液Input,阴性对照为小鼠IgG代替SP1抗体,以各组获得DNA做模板,用SP1结合位点相关引物行荧光定量PCR,观察各组荧光强度,判断在肿瘤细胞内SP1是否结合于GLUT3基因的启动子上。6)使用SPSS 17.0分析,计量资料用均数±标准差(X±s)表示,所有数据均为三次或三次以上重复试验所得结果。对所测结果进行正态性检验以及方差齐性检验,正态分布数据两组间均数比较采用独立样本t检验,多组均数间比较：方差齐同时整体比较采用One-way ANOVA,组间两两比较采用LSD法；方差不齐时整体比较采用welch检验,组间两两比较采用Tamhane's检验。检验水准设为α=0.05。结果：1)构建的重组质粒pGL3-GLUT3-wt.pGL3-GLUT3-mut,pIRES2-ZsGreenl-SP1经过测序,证实序列正确。2)与转染空载体pIRES2-ZsGreenl组相比,转染构建的SPl真核表达载体pIRES2-ZsGreenl-SP1可以使胶质瘤细胞中SP1-mRNA与GLUT3-mRNA相对表达量上升(SP1-mRNA/GADPH-mRNA:0.573±0.0900/0.0844±0.00919, t=-16.204, p 0.001:GLUT3-mRNA/GADPH-mRNA:0.513±0.0656/0.0392±0.0104, t=-21.401,p 0.001):SPl-protein与GLUT3-protein相对表达量上升(SP1-protein/GADPH-protein:0.414±0.0573/0.212±0.0394,t=-8.585. p 0.001:SP1-protein/GADPH-protein:0.337±0.0557/0.114±0.0400, t=-9.721,p 0.001).3)与转染pGL3-basic+pRL-TK组相比,在转染pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK组胶质瘤中相对荧光素酶活性明显增高(37.477±4.870/2.367±0.760,t=-21.370,P0.001)。4)转染pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1组、转染pGL3-GLUT3-mut+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1组和pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+ pIRES2-ZsGreenl组胶质瘤细胞中相对荧光素酶活性比较,经方差齐性检验,得levene统计量F=2.294,P=0.123,说明组间方差齐同,经单因素方差分析,得F=45.514,P0.001整体差异具有统计学意义。其中转染pGL3-GLUT3-Wt+ pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1组胶质瘤细胞中相对荧光素酶活性比转染pGL3-GLUT3-mut+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1组和pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+ pIRES2-ZsGreen1组高(56.561±11.012/27.212±5.920,LSD,P0.001,6.561±11.012/25.841±4.726,LSD,P0.001)。其中pGL3-GLUT3-mut+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl-SP1组和pGL3-GLUT3-wt+pRL-TK+pIRES2-ZsGreenl组中相对荧光素酶活性差异不大(27.212±5.920/25.841±4.726,LSD,p=0.710).结果提示GLUT3启动子区内SP1结合位是SP1上调GLUT3基因启动子活性的结构基础。6)免疫共沉淀结果显示：以各组获得的DNA为模板,以SP1结合位点相关引物行荧光定量PCR,各组相对荧光强度比较,经方差齐性检验,得levene统计量F=7.560,P=0.003,说明组间方差不齐,经welch检验,得F=421.377,P0.001整体差异具有统计学意义。组间比较结果显示SPl抗体沉降组相对荧光强度低于Input组(236.206±56.688/459.069±44.985,Tamhane's,p 0.001),而高于小鼠IgG组(236.206±56.688/23.278±11.148,Tamhane's,p 0.001),上述结果提示在胶质瘤细胞中SPl结合于GLUT3基因的启动子区。结论：转录因子SP1可以作用于GLUT3启动子区上SP1结合位点,并上调GLUT3启动子活性。
【关键词】：胶质瘤 葡萄糖转运体3 SP1 转录调控 启动子
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.41
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-21
• 第一章 GLUT3在胶质瘤中的异常表达及其意义21-69
• 引言21
• 第一节 胶质瘤在演进过程中GLUT3表达量与Ki-67表达量之间的相关性21-31
• 材料与试剂22-23
• 实验方法23-24
• 结果24-30
• 讨论30-31
• 第二节 抑制GLUT3表达后对胶质瘤生长特性的影响31-69
• 第一小节 GLUT3慢病毒干扰载体的构建与鉴定31-56
• 材料与试剂31-33
• 方法33-47
• 结果47-55
• 讨论55-56
• 第二小节 抑制GLUT3表达后对胶质瘤生长特性的影响56-69
• 材料与试剂56-58
• 方法58-61
• 结果61-67
• 讨论67-69
• 第二章 SP1参与胶质瘤中GLUT3的转录调控69-116
• 引言69-70
• 第一节 在胶质瘤中SP1对GLUT3基因表达的影响70-92
• 材料与试剂71-72
• 方法72-85
• 结果85-90
• 讨论90-92
• 第二节 SP1可以结合于GLUT3基因启动子区,并激活GLUT3的转录92-116
• 材料与试剂92-93
• 方法93-108
• 结果108-113
• 讨论113-116
• 全文总结116-118
• 后记与展望118-119
• 综述119-130
• 参考文献130-142
• 缩略词表142-144
• 在学期间所发表论文144-145
• 致谢145-147
• 统计学审稿证明147

  本文关键词：胶质瘤中GLUT3基因异常表达的意义及其相关调控机制，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：314503