老鹰茶总黄酮中主要黄酮苷类与其苷元的肠道转运特性及抗人肝癌细胞耐药的机制研究

发布时间：2017-04-18 09:09

  本文关键词：老鹰茶总黄酮中主要黄酮苷类与其苷元的肠道转运特性及抗人肝癌细胞耐药的机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：老鹰茶,又名豹皮樟,俗称“白茶”,是具有安徽地域特色的中药资源,主要分布于安徽省皖南山区。民间饮用表明老鹰茶具有解毒消肿、明目益思、生津止渴、解表防暑等功效。前期的研究表明,老鹰茶总黄酮TFLC为其活性部位,主要成分为槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-β-D-半乳糖苷、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷和山奈酚-3-O-a-L-鼠李糖苷这五种黄酮苷类,其在降血糖、抗炎、抗氧化、免疫调节等方面均具有显著预防和治疗作用。黄酮苷元槲皮素和山奈酚药理作用与老鹰茶总黄酮的药理作用相似,也具有抗炎、抗氧化及免疫调节等作用。虽然这些黄酮类化合物的很多药理活性被研究报道,但是关于它们的吸收特点和机理尚不明确。口服给药是常用的给药方式。肠道吸收作为口服药物进入人体的第一步,决定了药物的生物利用度和代谢动力学行为。构建一种细胞体外吸收模型来模拟人体小肠上皮的功能,对阐明药物在肠道的吸收特性,明确影响药物吸收和生物利用度的潜在因素至关重要。ABC(ATP-binding cassette,ATP结合盒)转运蛋白是一类具有ATP结合区域单向底物外排泵,主要参与细胞内药物吸收转运和外排等过程,以主动转运方式完成多种分子的跨膜转运。目前已有研究证实,ABC转运蛋白家族中的P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白2(MRP2)与肿瘤细胞化疗中产生的多药耐药性(mulitidrug resistance,MDR)密切相关,但具体机制不详。因此本课题以caco-2、mdck及人肝癌耐药细胞株为研究对象,从以下三个方面开展实验,研究老鹰茶总黄酮中主要黄酮苷类及其相对应的黄酮苷元的吸收转运特性,同时探讨这些成分与转运蛋白之间的相互作用及机制。一、老鹰茶总黄酮中主要黄酮苷类与其苷元在caco-2/mdck细胞上的吸收转运实验利用caco-2和mdck两种细胞模型模拟人体小肠上皮,在细胞水平上研究老鹰茶总黄酮中主要黄酮苷类及其苷元的吸收特性、转运机理以及相互作用。在实验考察的转运浓度范围内(40、80、160μm),山奈酚-3-o-a-l-鼠李糖苷的跨细胞转运可能以被动扩散为主,而槲皮素-3-o-β-d-半乳糖苷、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷、山奈酚-3-o-β-d-半乳糖苷、山奈酚-3-o-β-d-葡萄糖苷、槲皮素和山奈酚在双向转运过程中都具有浓度依赖性、ph值依赖性和能量依赖性,提示它们的跨细胞转运过程可能既有被动扩散,又有主动转运。槲皮素和山奈酚具有明显的外排现象,外排率er远远大于2。主动转运蛋白(sglt1)的抑制剂根皮苷对槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷和山奈酚-3-o-β-d-葡萄糖苷的吸收有一定的促进作用,易化扩散蛋白(glut2)抑制剂根皮素对槲皮素-3-o-β-d-半乳糖苷、槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷、山奈酚-3-o-β-d-半乳糖苷和山奈酚-3-o-β-d-葡萄糖苷的吸收均有一定的促进作用。p-糖蛋白(p-gp)抑制剂维拉帕米对于黄酮苷类的外排没有明显的作用,但是对其苷元槲皮素和山奈酚的外排有抑制作用;而多药耐药相关蛋白2(mrp2)抑制剂mk571和丙磺舒对于黄酮苷类和苷元的外排均有不同程度的抑制。当这些成分两两相互作用后,苷元槲皮素和山奈酚可以促进部分黄酮苷类的吸收,苷元槲皮素和山奈酚之间可以相互促进,但是黄酮苷类之间却没有明显的促进或抑制作用。二、老鹰茶总黄酮中主要黄酮苷类与其苷元对caco-2细胞和人肝癌耐药bel-7402/5-fu细胞中abc转运蛋白的调控作用由于abc转运蛋白在药物吸收动力学中发挥着很重要的作用,因此实验考察了黄酮苷类及其苷元对caco-2细胞和人肝癌耐药bel/5-fu细胞中abc转运蛋白(mdr1/p-gp、mrp2)表达和功能活性的影响。在caco-2细胞单层中,黄酮苷元槲皮素(40、80、160μm)和山奈酚(80、160μm)可以明显降低转运蛋白底物的外排率,但是黄酮苷类对转运蛋白的功能没有明显的作用。bel/5-fu细胞经过苷元槲皮素(40、80、160μm)预处理后,能够明显下调转运蛋白基因的表达,增强细胞内转运蛋白底物的荧光强度,作用类似于转运蛋白的抑制剂。同时,bel/5-fu细胞经过槲皮素(40、80、160μm)预处理后,能够明显降低5-fu的ic50值,增加细胞敏感性,逆转了细胞耐药性。三、黄酮苷元槲皮素通过抑制fzd7/β-catenin通路下调人肝癌耐药细胞bel-7402/5-fu中abc转运蛋白的表达逆转多药耐药近年来,abc转运蛋白介导的多药耐药在肝癌耐药中占有很大的比例,因此对abc转运蛋白进行干预成为逆转肝癌化疗耐药的重要途径。越来越多的研究表明wnt/β-catenin信号通路与abc转运蛋白之间有密切的联系。文献报道wnt蛋白的受体frizzled(fzd)7在肝癌耐药细胞株中过表达,作为wnt/β-catenin通路必不可少的组成元件,fzd7表达的改变可影响信号通路的调控进而逆转肿瘤耐药。前期研究发现黄酮苷元槲皮素可以浓度依赖性地抑制abc转运蛋白的表达和功能。为了考察黄酮苷元槲皮素对abc转运蛋白的调控机制,进行了相关实验研究。结果发现bel-7402和bel/5-fu细胞中fzd7、mdr1/p-gp和mrp2均异常表达,而在bel/5-fu耐药细胞株中的表达均明显高于其亲本细胞株bel-7402。转染fzd7sirna(sifzd7)有效沉默fzd7后,细胞浆内β-catenin、细胞核内β-catenin、mdr1/p-gp、mrp2的mrna和蛋白水平均明显下降,5-fu、mmc和adr的ic50值明显下降,bel/5-fu细胞内rh123和adr的蓄积量增加;转染过表达质粒gv144-fzd7后与sifzd7的结果相反。β-catenin的抑制剂icrt-3也能明显抑制下游mdr1/p-gp和mrp2的mrna和蛋白表达水平。当用不同浓度的槲皮素(40、80、160μm)处理耐药细胞后,发现其能够明显抑制fzd7、细胞浆内β-catenin、细胞核内β-catenin、mdr1/p-gp、mrp2的mrna和蛋白表达,具有浓度依赖性。同时,与槲皮素加sifzd7的阴性对照组sncrna(q+sncrna)相比,槲皮素加sifzd7共同处理组(q+sifzd7)可使得fzd7、细胞浆内β-catenin、细胞核内β-catenin、mdr1/p-gp、mrp2mrna和蛋白表达水平明显增加。提示槲皮素调控ABC转运蛋白(MDR1/P-gp、MRP2)的表达可能与抑制FZD7/β-catenin信号通路有关。综上可知,老鹰茶总黄酮中主要黄酮苷类及其苷元的吸收可能与ABC转运蛋白(MDR1/P-gp、MRP2)密切相关,其中苷元槲皮素可能是通过FZD7/β-catenin信号通路从而调控ABC转运蛋白(MDR1/P-gp、MRP2)的表达和功能。
【关键词】：黄酮类化合物 吸收 外排 转运蛋白 多药耐药
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R285
【目录】：

• 中英文缩写词对照8-11
• 中文摘要11-15
• 英文摘要15-19
• 第一部分 老鹰茶总黄酮中主要黄酮苷类与其苷元在Caco-2/MDCK细胞上的吸收转运19-63
• 1. 前言19-22
• 2. 实验材料22-25
• 2.1 药品与试剂22-24
• 2.2 仪器和设备24-25
• 3. 实验方法25-38
• 3.1 细胞单层模型的建立25-26
• 3.2 细胞单层模型的验证26-27
• 3.3 培养液中待测物的测定方法27-28
• 3.4 MTT法测定细胞毒性28-29
• 3.5 TFLC中主要黄酮苷类及其苷元的双向转运试验29
• 3.6 转运介质pH值对主要黄酮苷类及其苷元转运的影响29
• 3.7 TFLC中主要黄酮苷类及其苷元转运的能量依赖性试验29
• 3.8 Real-time qPCR检测Caco-2、MDCK细胞中MDR1，MRP2，SGLT1和GLUT2 mRNA的表达29-32
• 3.9 Western Blot法检测Caco-2、MDCK细胞中P-gp，MRP2，SGLT1和GLUT2蛋白表达32-37
• 3.10 TFLC中主要黄酮苷类及其苷元介导的转运动力学试验37
• 3.11 TFLC中主要黄酮苷类及其苷元在MDCK细胞模型上双向转运的相互作用37-38
• 3.12 实验数据处理及参数计算38
• 3.13 统计学分析38
• 4. 实验结果38-58
• 4.1 细胞单层模型的建立和验证38-41
• 4.2 培养液中待测物的测定方法的评价41-44
• 4.3 MTT法测定细胞毒性44-45
• 4.4 TFLC中主要黄酮苷类及其苷元在Caco-2、MDCK细胞中的双向转运45-50
• 4.5 转运介质pH值对主要黄酮苷类及其苷元转运的影响50-51
• 4.6 温度以及ATP酶抑制剂对主要黄酮苷类及其苷元转运的影响51-52
• 4.7 Caco-2 和MDCK细胞中MDR1，MRP2，SGLT1和GLUT2 mRNA和蛋白表达52-55
• 4.8 不同抑制剂对主要黄酮苷类及其苷元的影响55-58
• 4.9 TFLC中主要黄酮苷类及其苷元双向转运的相互作用58
• 5. 讨论58-63
• 第二部分 老鹰茶总黄酮中主要黄酮苷类与其苷元对Caco-2细胞和人肝癌耐药BEL-7402/5-FU细胞中ABC转运蛋白的调控作用63-77
• 1. 前言63-65
• 2. 实验材料65
• 2.1 药品与试剂65
• 2.2 仪器和设备65
• 3. 实验方法65-68
• 3.1 细胞培养65
• 3.2 转运蛋白底物在Caco-2 细胞单层中的转运试验65-66
• 3.3 Real-time qPCR检测BEL-7402和BEL/5-FU细胞中ABC转运蛋白基因的表达66
• 3.4 荧光显微镜观察黄酮苷元槲皮素对BEL/5-FU细胞内Rh123和ADR蓄积的影响66-67
• 3.5 流式细胞仪检测黄酮苷元槲皮素对BEL/5-FU细胞内Rh123和ADR蓄积的影响67
• 3.6 MTT法检测黄酮苷元槲皮素对BEL/5-FU细胞耐药性的影响67-68
• 3.7 统计学分析68
• 4. 实验结果68-75
• 4.1 TFLC中主要黄酮苷类及其苷元对Caco-2 细胞中ABC转运蛋白活性的影响68-69
• 4.2 槲皮素对BEL-7402、BEL/5-FU细胞中ABC转运蛋白MDR1、MRP2 mRNA表达水平的影响69-71
• 4.3 槲皮素对BEL/5-FU细胞内Rh123和ADR蓄积的影响71-74
• 4.4 槲皮素对BEL/5-FU细胞耐药性的影响74-75
• 5. 讨论75-77
• 第三部分 黄酮苷元槲皮素通过抑制FZD7/β-catenin通路下调人肝癌耐药细胞BEL-7402/5-FU中ABC转运蛋白的表达逆转多药耐药77-102
• 1. 前言77-78
• 2. 实验材料78-79
• 2.1. 药品与试剂78
• 2.2 仪器和设备78-79
• 3. 实验方法79-83
• 3.1 BEL-7402和BEL/5-FU细胞的培养79
• 3.2 细胞转染79
• 3.3 Real-time qPCR检测BEL-7402和BEL/5-FU细胞中FZD7、β-catenin、MDR1和MRP2 mRNA的表达79-81
• 3.4 Western Blot法检测BEL-7402和BEL/5-FU细胞中FZD7、β-catenin、P-gp和MRP2蛋白的表达81-82
• 3.5 MTT法测定FZD7对BEL/5-FU细胞耐药性的影响82
• 3.6 MTT法测定细胞毒性82-83
• 3.7 荧光显微镜观察FZD7对BEL/5-FU细胞内Rh123和ADR蓄积的影响83
• 3.8 流式细胞仪检测FZD7对BEL/5-FU细胞内Rh123和ADR蓄积的影响83
• 4. 实验结果83-100
• 4.1 BEL-7402和BEL/5-FU细胞中FZD7、MDR1/P-gp和MRP2的异常表达83-85
• 4.2 FZD7/β-catenin对BEL/5-FU细胞中ABC转运蛋白表达的影响85-91
• 4.3 FZD7对BEL/5-FU细胞耐药性的影响91-94
• 4.4 槲皮素对BEL/5-FU细胞的生长抑制作用以及无毒剂量的筛选94-95
• 4.5 槲皮素对BEL/5-FU细胞中ABC转运蛋白表达的影响95-96
• 4.6 槲皮素通过抑制FZD7/β-catenin信号通路从而抑制ABC转运蛋白的表达96-100
• 5. 讨论100-102
• 结论102-104
• 参考文献104-115
• 附录115-118
• 致谢118-119
• 综述119-151
• References137-151

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张悦,杨晓达,王夔;2,6-吡啶二羧酸钒(Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ)配合物透过MDCK细胞单层的能力以及与Caco-2细胞单层的比较[J];科学通报;2005年14期

  本文关键词：老鹰茶总黄酮中主要黄酮苷类与其苷元的肠道转运特性及抗人肝癌细胞耐药的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：314516