PIK3R1基因在肾细胞癌中的功能及调控机制研究

发布时间：2017-04-18 11:10

  本文关键词：PIK3R1基因在肾细胞癌中的功能及调控机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤,近年来发病率呈持续上升趋势,严重威胁人类生命健康。肾细胞癌常发病隐匿,约30%肾细胞癌在初次诊断时已发生转移。肾细胞癌对放化疗不敏感,根治性手术切除是其唯一有效的治疗方式,但是术后肿瘤复发转移率仍较高。肾细胞癌转移(metastatic renal cell carcinoma, mRCC)预后不良,5年生存率10%。多项多中心的询证医学研究表明,分子靶向药物可延长肾细胞癌转移患者的生存期,然而效果仍十分有限。肾细胞癌转移对肾细胞癌的治疗构成了极大的挑战。肾细胞癌起源于肾小管上皮细胞,其中约75%为肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)。目前研究表明,VHL (von Hippel-Lindau tumor suppressor, VHL)、SETD2 (SET domain containing 2, SETD2)及PBRM1 (polybromo 1, PBRM1)等基因突变和表达异常与肾细胞癌相关。亦有研究发现,泛素介导的蛋白降解通路(ubiquitin-mediated proteolysis pathway, UMPP)相关基因突变也是肾细胞癌的发病机制之一。与肾细胞癌相关的新基因的不断发现表明,目前对肾细胞癌的分子机制研究尚不完全。除UMPP信号通路外,磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B, AKT)信号通路也被认为是肾细胞癌的重要信号通路。PI3K是通过结合定位于质膜的受体而激活,并通过磷酸化磷脂酰肌醇4,5二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate, PIP2)产生磷脂酰肌醇-3-磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate, PIP3)。AKT通过PH结构域(pleckstrin homology domain, PH)结合PIP3,从而形成磷酸化的AKT (phosphorylated AKT, pAKT),进而启动PI3K/AKT信号通路。I型P13K是PI3Ks家族中被最广泛研究的分子,它由一个催化亚基和调节亚基构成,具有类脂激酶和蛋白激酶的双重活性。催化亚基p110a由PIK3CA基因编码,而调节亚基p85a由PIK3R1基因编码。AKT是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,是PI3K主要下游效应分子之一,可通过直接磷酸化多种转录因子,调节细胞生长、增殖、转化和存活等多种生命活动过程。PI3K/AKT信号通路中的关键编码基因如PIK3CA、AKT和PTEN等结构改变使PI3K活化过程中通过正常酪氨酸激酶受体RTK (receptor tyrosine kinase)信号对p85/p110复合物的负调节作用被解除,从而导致PI3K的组成性活化和细胞转化。PI3K/AKT信号通路在人类肿瘤谱中广泛失调。文献报道,该信号通路改变在乳腺癌、黑色素瘤、淋巴瘤、子宫内膜癌、卵巢癌、结肠癌和尿路上皮癌等多种肿瘤发病机制中发挥重要作用。该信号通路成分异常引起的功能失调亦与肿瘤的侵袭转移密切相关。癌症基因组图谱研究网络(The Cancer Genome Atlas Research Network, TCGA)对450例ccRCC和对应的癌旁肾正常组织测序分析发现,29%肾癌组织存在PI3K/AKT信号通路相关基因突变,并推测PI3K/AKT信号通路相关基因改变引起的信号通路异常可能与肾细胞癌侵袭相关。PI3K/AKT信号通路在肾细胞癌发病机制中发挥着重要作用,因此该信号通路展现出作为肾细胞癌分子靶向治疗的良好前景。目前开发的相关药物主要包括PI3K、AKT和mTOR抑制剂。然而,仅有少数患者从该通路靶向药物治疗中获益,所以还有待进一步明确此类药物治疗肾细胞癌效果不佳的相关机制。除目前较为普遍研究的PIK3CA和PTEN分子外,该信号通路的其他分子是否也在肾细胞癌发病机制中发挥作用,并可成为有效治疗靶点?越来越多的研究表明,PIK3R1基因在肿瘤生物分子机制中亦发挥重要作用。PIK3R1基因在卵巢癌和结肠癌中发挥癌基因作用,然而在肝细胞癌中却发挥抑癌基因的作用。PIK3R1的错义突变所致PIK3R1基因表达下调也与结肠癌存在关联性。有学者对一位肾细胞癌患者的原发病灶、腔静脉癌栓、脑转移病灶进行测序分析发现,仅脑转移灶存在PIK3R1基因无义突变。PIK3R1基因无义点突变可使P85亚单位多肽链翻译中止,从而导致PIK3R1基因表达量降低。因此,我们推测PIK3R1基因表达下调可能使肾癌细胞获得易位、远处定植和生长的优势。综上所述,肾细胞癌发病率呈逐年上升趋势,PI3K/AKT信号通路是肾细胞癌的重要信号通路,目前尚未有研究探讨PIK3R1基因在肾细胞癌中的功能,所以我们认为有必要明确PIK3R1基因在肾细胞癌中的作用。本研究首先通过免疫组织化学和实时荧光定量PCR (real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测分析PIK3R1基因在肾细胞癌组织(包括肾细胞癌原发病灶和肾细胞癌转移病灶)的表达情况,并且应用CRISPR/Cas9系统构建了PDGR1基因低表达细胞模型,随后通过肿瘤集落形成、皮下成瘤、肿瘤细胞迁移、上皮-间质转化及肿瘤细胞成球等实验,探讨PDGR1基因在肾细胞癌中的功能及调控机制。本论文可分为以下六章。第一章PIK3R1基因在肾细胞癌组织的表达分析目的：探讨PIK3R1基因在肾细胞癌和肾正常组织的表达情况。方法：收集2008年5月至2013年4月间在我院行肾癌根治性切除术的13例患者的石蜡包埋的癌旁肾正常组织、对应的肾细胞癌原发病灶组织、肾细胞癌转移病灶组织,采用免疫组织化学技术检测组织中PIK3R1基因蛋白表达量。同时亦收集2009年5月至2013年9月间在我院行肾细胞癌转移病灶的活组织穿刺病理检查,但未行肾癌根治性切除术的8例患者的转移病灶组织的石蜡包埋组织,采用免疫组化技术检测组织中PIK3R1基因蛋白表达量。我们也收集2012年8月至2013年10月间在我院行肾癌根治性切除术的18例患者的肾细胞癌原发病灶及对应的癌旁肾正常组织,采用RT-PCR技术检测组织中PIK3R1基因mRNA表达量。结果：免疫组化结果显示,肾细胞癌原发灶和转移灶PDGR1蛋白表达量均显著低于正常肾组织PIK3R1基因蛋白表达量(P0.001,P0.001)；同时,肾细胞癌转移灶组织PIK3R1基因蛋白表达量亦显著低于肾细胞癌原发灶组织PDGR1蛋白表达量(P0.001)。实时荧光定量PCR结果显示,肾细胞癌原发病灶组织PIK3R1基因mRNA表达量显著低于正常肾组织PIK3R1基因mRNA表达量(0.5286±0.4671 VS 2.4872±0.6466, t=0.417, P0.001)=T2和T3-4期肾细胞癌组织的PDGR1基因mRNA表达量均显著低于T1期肾细胞癌组织的PDGR1基因mRNA表达量(P0.001,P=0.001)；同时T3-4肾细胞癌组织的PDGR1基因mRNA表达量亦显著低于T2期肾细胞癌组织的PDGR1基因mRNA表达量(P=0.004)。线性分析表明,PDGR1基因表达量与NCAD基因表达量呈负性相关(Person r=-0.6929, P=0.0014; y=-1.0978x+2.8781, R2=0.4801)。结论：PDGR1基因表达量在肾正常组织中最高,而在肾细胞癌原发灶组织和转移灶组织中依次降低。PDGR1基因表达量与肿瘤分期相关,晚期肿瘤组织的表达量低于早期肿瘤组织的表达量。PDGR1基因表达量与NCAD基因表达量呈负性相关。PDGR1基因在肾细胞癌中可能发挥抑癌基因的作用,该基因表达下调可能与肾细胞癌的进展和转移相关,但仍需细胞功能研究来进一步明确其在肾细胞癌中的作用。第二章PIK3R1基因表达下调促进肾癌细胞增殖目的：通过CRISPR/Cas9技术构建PDGR1基因低表细胞模型,并在细胞模型的基础上研究PDGR1基因表达下调对肾细胞癌增殖和肿瘤形成的影响。方法：首先,采用RT-PCR分析正常肾小管上皮细胞株(HK2)和肾癌细胞系(786-0, A-498, A-704和ACHN)的PDGR1基因表达水平。其次,通过CRISPR/Cas9系统敲减野生型肾癌细胞(786-O和A-704)的PDGR1基因、G418药物筛选细胞单克隆,构建PDC3R1基因低表达细胞模型。随后,采用RT-PCR和Western blot技术检测野生型肾癌细胞和构建的细胞模型(786-mut1、 786-mut2、A-704-mut1和A-704-mut2)的PIK3R1基因的表达情况。最后,应用野生型和细胞模型进行细胞平板克隆形成和皮下成瘤实验,评估PIK3R1基因对肿瘤细胞增殖和肿瘤形成能力的作用。结果：786-0和A-704细胞PIK3R1基因表达量均显著高于HK2细胞PIK3R1基因表达量(P=0.021,P=0.038)。786-0和A-704肾癌细胞PIK3R1基因在chr5：67576819位点附近碱基未发生基因突变。因此,选择786-0和A-704细胞系来构建PIK3R1基因低表达模型。采用CRISPR/Cas9技术、G418药物筛选和Sanger测序验证后,获得发生PIK3R1基因单倍体缺失突变的786-mut1、786-mut2、 A-704-mut1和A-704-mut2细胞。与野生型细胞相比,786-mut1和786-mut2细胞的PIK3R1基因的mRNA表达量均显著下降(P0.001,P0.001)。786-mut1和786-mut2细胞的PIK3R1基因蛋白表达量也降低。与野生型细胞相比,A-704-mutl和A-704-mut2细胞的PIK3R1基因mRNA的表达量亦均显著下降(P0.001,P0.001)。A-704-mut1和A-704-mut2细胞的PIK3R1基因蛋白表达量也降低。与野生型细胞相比,786-mutl和786-mut2细胞的平板克隆数均显著性增加(P0.001,P=0.002); A-704-mut1和A-704-mut2细胞的平板克隆量亦均显著增加(P0.001,P=0.001)。786-mut1和786-mut2细胞肿瘤体积均显著大于野生型786-0细胞形成的肿瘤体积(P=0.004,P=0.006)。A-704-mut1和A-704-mut2细胞的肿瘤体积亦均显著大于野生型A-704细胞形成的肿瘤体积(P=0.006,P=0.009)。结论：CRISPR/Cas9系统构建的细胞模型(786-mut1、786-mut2、A-704-mut1和A-704-mut2)的PIK3R1基因较野生型细胞的表达明显下降,表明已成功构建PIK3R1基因低表达细胞模型。平板克隆形成实验和皮下成瘤实验表明,PIK3R1基因低表达细胞的增殖能力和成瘤能力强于野生型细胞,进一步提示PIK3R1基因在肾癌中可能发挥抑癌基因作用。第三章PIK3R1基因表达下调促进肾癌细胞迁移和上皮-间质转化目的：明确PK3R1基因表达下调对肾癌细胞迁移能力和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响。方法：在前期构建的PIK3R1基因低表细胞模型的基础上,应用野生型和PIK3R1基因低表细胞进行细胞划痕和transwell小室实验。同时,应用RT-PCR和WB技术检测细胞上皮-间质转化相关基因的mRNA和蛋白的表达量。结果：划痕18小时后,786-mut1和786-mut2细胞的迁移面积明显大于786-O细胞的迁移面积。A-704-mut1和A-704-mut2细胞的迁移面积亦明显大于A-704细胞的迁移面积。穿过Transwell小室膜的786-mut1和786-mut2细胞明显多于786-O细胞。穿过Transwell小室的A-704-mutl和A-704-mut2细胞亦明显多于A-704细胞。PIK3R1低表达肾癌细胞(786-mut1、786-mut2、A-704-mutl和A-704-mut2)表现出间质细胞的形态特征。与野生型786-O细胞相比,786-mut1和786-mut2细胞的ECAD基因表达量均显著下降(P=0.034, P=0.041); NCAD、VIM和ZEB1基因表达量均显著升高(P=0.010, P=0.022)、(P=0.021,P=0.037)、(P=0.043,P=0.018)。然而,与野生型786-O细胞相比,786-mut1和786-mut2细胞的CD44基因表达量虽然均增高,但差异无统计学意义(P=0.224,P=0.067)。786-O与786-mut1和786-mut2细胞组间POU5F1基因表达量无显著性差异(F=3.971,P=0.080)。与野生型A-704细胞相比,A-704-mut1和A-704-mut2细胞的ECAD基因表达量均显著下降(P=0.035, P=0.033); NCAD、VIM、ZEB1基因基因表达量均显著升高(P=0.014,P=0.043)、(P=0.012, P=0.010)、(P=0.015, P=0.013)。然而,与野生型A-704细胞相比,A-704-mut1和A-704-mut2细胞的CD44基因表达量虽然均增高,但差异无统计学意义(P=0.082,P=0.051)。A-704与A-704-mut1和A-704-mut2细胞组间POU5F1基因表达量均数无显著性差异(F=2.803,P=0.138)。结论：PIK3R1基因低表达可引起EMT相关基因表达变化,导致肾癌细胞发生EMT,进而促进肾癌细胞的迁移。PK3R1基因表达下调可能与肾细胞癌的侵袭和转移相关。第四章PIK3R1基因表达下调促进肾癌细胞的干性目的：分析野生型细胞和PIK3R1基因低表达细胞的肾癌细胞干性表型。方法：首先,通过体外无血清培养基培养野生型细胞和PIK3R1基因低表细胞,观察两种细胞的干细胞球形成情况。其次,分别使用抗CD44、CD133和CXCR4抗体标记野生型细胞和PIK3R1低表达细胞模型,随后进行流式细胞仪分析细胞亚群。最后,采用RT-PCR检测野生型细胞和PIK3R1基因低表达细胞的干细胞相关基因表达情况。结果：无血清培养基中培养2周后,与野生型786-0细胞相比,786-mut1和786-mut2细胞形成的干细胞球数均显著增加(P0.001,P0.001)。与野生型A-704细胞相比,A-704-mut1和A-704-mut2细胞形成的干细胞球数亦均显著增多(P0.001,P0.001)。与野生型786-0细胞相比,786-mutl和786-mut2细胞中CD44、CD 133和CXCR4阳性细胞亚群均显著增多(P0.001,P0.001)、(P0.001,P0.001)、(P=0.005P=0.006)。与野生型A-704细胞相比,A-704-mutl和A-704-mut2细胞中CD44、CD133、CXCR4阳性细胞亚群均显著增多(P0.001,P0.001)、(P0.001,P0.001)、(P0.001, P0.001)。PIK3R1低表细胞中CD44、CD133和CXCR4阳性细胞亚群比例高于野生型细胞中的该类型细胞亚群比例。与786-0细胞相比,786-mmutl和786-mut2细胞中CTNNB1基因表达量显著增高(P0.001,P0.001)。整体而言,786-0、786-mut1和786-mut2细胞组间HES1、GLI1和NANOG基因表达量均数无有显著差异(F=4.400,P=0.067)(F=2.350,P=0.176)、(F=1.339,P=0.330)。与A-704细胞相比,A-704-mutl和A-704-mut2细胞中CTNNB1基因表达量也显著升高(P=0.019,P=0.033); HES1基因表达量下降,但是差异无统计学意义(P=0.075、P=0.061)。整体而言,A-704、A-704-mut1和A-704-mut2细胞间GL11基因表达量均数无显著差异(F=5.205,P=0.096)。与野生型A-704细胞相比,A-704-mutl和A-704-mut2细胞NANOG基因表达量均显著下降(P0.001,P0.001)。总之,与野生型细胞相比,在PIK3R1基因低表细胞中CTNNB1基因表达量均升高。结论：PIK3R1基因低表达可促进肾癌细胞的干性表型。CTNNB1基因可能在PIK3R1基因表达下调促进肾癌细胞干性表型过程中发挥重要作用。然而,PIK3R1基因低表达促进肾癌细胞干性表型的分子机制还有待于进一步研究。第五章PIK3R1基因表达下调通过AKT磷酸化激活WNT/β-catenin信号通路目的：分析PIK3R1基因低表细胞中PI3K/AKT信号通路及其相关通路的激活情况,以期明确PIK3R1基因调控肾癌细胞功能的分子机制。方法：首先,采用免疫共沉淀和WB技术分析野生型和PIK3R1基因低表达细胞中PIK3R1蛋白和P110蛋白的结合水平。其次,采用WB技术检测AKT、磷酸化AKT、ERK、磷酸化ERK、GSK3β、磷酸化GSK3p和CTNNB1蛋白表达水平。最后,亦通过慢病毒敲减PIK3R1低表达细胞(786-mut1和A-704-mut2)的AKT基因,通过WB技术检测磷酸化AKT、GSK3β、磷酸化GSK3β和CTNNB1蛋白。结果：与野生型细胞相比,PIK3R1基因低表细胞(786-mut1、786-mut2、 A-704-mut1和A-704-mut2)中与PIK3R1蛋白结合的p110α蛋白量降低,同时磷酸化AKT的表达量增加。我们亦发现PIK3R1基因低表细胞的CTNNB1蛋白和磷酸化GSK3β蛋白表达量升高。慢病毒敲减786-mutl和A-704-mut2细胞的AKT基因后我们发现,与未行AKT基因敲减的细胞相比,AKT基因敲减细胞的pAKT、p-GSK3β和CTNNB1的表达量均下降。结论：PIK3R1基因低表细胞中PI3K/AKT信号通路激活,并可通过AKT分子活化引起GSK3β磷酸化水平升高,导致CTNNB1表达量升高,进而导致WNT/CTNNB1信号通路激活。CTNNB1基因可能在PIK3R1基因表达下调促进肾癌细胞干性表型中发挥重要作用,故有必要进一步明确该基因在此过程中的调控作用。第六章PIK3R1基因表达下调激活WNT/β-catenin信号通路促进肾癌细胞干性目的：探讨CTNNB1基因在PDGR1基因表达下调促进肾癌细胞干性表型中发挥的作用。方法：首先,通过慢病毒敲减PIK3R1基因低表细胞的CTNNB1基因,在PI3R1基因低表细胞的基础上构建CTNNB1基因低表达细胞(786-mutlshCTNNB1和A-704-mut2 shCTNNB1细胞),并通过RT-PCR和WB技术分别检测细胞中CTNNB1基因mRNA和蛋白表达量。其次,通过体外无血清肿瘤干细胞球培养786-mut1 shCtrl、A-704-mut2 shCtrl、786-mut1 shCTNNB1和 A-704-mut2 shCTNNB1细胞。同时,通过抗体标记和流式细胞仪分析786-mutlshCtrl、A-704-mut2 shCtr1、786-mut1 shCTNNB1和A-704-mut2 shCTNNB1细胞中CD44、CD133和CXCR4细胞亚群情况。最后,通过免疫缺陷小鼠的皮下成瘤实验,分析786-mut1 shCTNNB1、A-704-mut2 shCTNNB1、786-mut1 shCtr1和A-704-mut2 shCtr1细胞的成瘤能力。结果：与786-mut1 shCtr1细胞相比,786-mut1 shCTNNB1细胞的CTNNB1基因mRNA表达量显著降低(0.0722±0.0233 VS 1.0035±0.0605,t=24.892,P0.001)。与A-704-mut2 shCtr1细胞相比,A-704-mut2 shCTNNB1细胞的CTNNB1基因mRNA表达量亦显著降低(0.0996±0.0325 VS 1.005267±0.0935, t=15.847, P0.001)。786-mut1 shCTNNB1和A-704-mut2 shCTNNB1细胞中CTNNB1基因的蛋白表达量亦明显下降。在无血清培养基中培养两周后,我们发现,与786-mut1 shCtr1细胞相比,786-mut1 shCTNNB1细胞形成的干细胞球数显著降低(8.00±2.4495 VS70.00±3.4278,t=44.148,P0.001)。与A-704-mut2 shCtr1细胞相比,A-704-mut2 sh CTNNB1细胞的干细胞球数亦显著降低(11.3333±2.1213 VS 54.00士5.2202,t=22.716,P0.001)。流式细胞仪分析提示,与786-mut1 shCtr1细胞相比,786-mut1 shCTNNB1细胞中CD44、CD133和CXCR4阳性细胞亚群亦显著降低(P0.001,P0.001,P0.001)。与A-704-mut2 shCtrl细胞相比,A-704-mut2 shCTNNB1细胞中CD44、CD133和CXCR4阳性细胞亚群显著降低(P0.001,P0.001,P0.001)。皮下注射细胞30天后,786-mut1 shCTNNB1细胞形成的肿瘤体积显著小于786-mut1 shCtr1细胞形成的肿瘤体积(253.13±79.5903 VS 923.4867±98.1402, t=9.189, P=0.001)。A-704-mut2 shCTNNB1细胞形成的肿瘤体积显著小于A-704-mut2 shCtrl细胞形成的肿瘤体积(308.3033±75.4051 VS 75.4051±134.6369,t=9.149, P=0.001)。结论：PI3K/AKT信号通路和WNT/CTNNB1信号通路相互交叉,形成PI3K/AKT/GSK3P/CTNNB1信号通路。CTNNB1基因在PIK3R1基因表达下调促进肾癌细胞干性表型中发挥的重要作用。PIK3R1基因低表达通过激活PI3K/AKT/CTNNB1信号通路促进肾癌细胞的自我更新和肿瘤形成。
【关键词】：PIK3R1基因 表达下调 肿瘤迁移 肿瘤干细胞 肾细胞癌
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.11
【目录】：

• 摘要3-13
• ABSTRACT13-23
• 前言23-27
• 第一章 PIK3R1基因在肾细胞癌组织的表达分析27-38
• 引言27
• 材料和方法27-33
• 结果33-36
• 讨论36-38
• 第二章 PIK3R1基因表达下调促进肾癌细胞增殖38-55
• 引言38
• 材料和方法38-47
• 结果47-53
• 讨论53-55
• 第三章 PIK3R1基因表达下调促进肾癌细胞迁移和上皮-间质转化55-68
• 引言55
• 材料和方法55-60
• 结果60-65
• 讨论65-68
• 第四章 PIK3R1基因表达下调促进肾癌细胞的干性68-79
• 引言68
• 材料和方法68-72
• 结果72-77
• 讨论77-79
• 第五章 PIK3R1基因表达下调通过AKT磷酸化激活WNT/β-catenin信号通路79-88
• 引言79
• 材料和方法79-82
• 结果82-85
• 讨论85-88
• 第六章 PIK3R1基因表达下调激活WNT/β-catenin信号通路促进肾癌细胞干性88-98
• 引言88
• 材料和方法88-92
• 结果92-96
• 讨论96-98
• 全文总结98-100
• 综述100-106
• 参考文献106-115
• 博士学习期间发表论文115-116
• 缩略词表116-117
• 致谢117-120
• 统计学证明120

  本文关键词：PIK3R1基因在肾细胞癌中的功能及调控机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：314736