温莪术内生真菌突变株代谢产物研究

发布时间：2017-04-18 11:17

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【摘要】：植物内生真菌是指寄居于健康植物组织或细胞内而不引起宿主产生明显病症的一类微生物。其代谢产物种类丰富、生理活性多样,是抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等天然活性物质的重要来源。本文主要采用活性追踪的方法,研究了药用植物温莪术内生真菌突变株的次级代谢产物,旨在获得天然活性物质,为制备植物药用有效成分探索新途径。内容包括：温莪术内生真菌的分离、鉴定及活性菌株的筛选；活性菌株EZG0807分子生物学鉴定及其生物学性质研究；利用超导磁体模拟空间环境条件对菌株EZG0807进行诱变及其突变株的筛选；突变株M7226发酵条件优化；菌株M7226次级代谢产物的分离、纯化及其结构表征；菌株M7226次级代谢产物生物活性研究。结果如下：(1)采用组织块表面消毒法从温莪术根、茎和叶中分离得到66株内生真菌,经形态学鉴定,分别归属于5目、7科、14属,其中优势属为青霉属(Penicillium)、镰孢霉属(Fusarium)和曲霉属(Aspergillus);抗菌活性实验结果显示温莪术根部内生真菌EZG0807对四种指示细菌(Escherichia coli、Proteus vulgaris、Bacillus subtilis和Staphylococcus aureus)和四种指示真菌(Microzyme、Aspergillus niger、Rhizopus和Mucor)均具有较强的抑制作用；该菌株经形态学观察和真菌ITS序列分析,鉴定为Gibberella moniliformis,命名为Gibberella moniliformis EZG0807,并将其ITS序列提交至GenBank,登录号为JQ003920。(2)利用大梯度超导磁体模拟空间环境对G. moniliformis EZG0807进行诱变,并采用AFLP分子标记技术对其诱变机制进行探索,实验结果表明：大梯度超导磁体模拟空间环境条件使出发菌株G moniliformis EZG0807DNA条带发生缺失,导致基因突变。(3)采用稀释涂布平板法对诱变后菌株G. moniliformis EZG0807分离和纯化,得到139株突变菌株；经滤纸片抑菌法初筛和MTT法抗肿瘤细胞活性实验复筛,得到1株高活性且遗传稳定的突变菌株M7226。与出发菌株G. moniliformis EZG0807相比,M7226发酵液对四种指示细菌E. coli、P. vulgaris、B. subtilis和S. aureus的抑制能力均有所提高,对人非小细胞肺癌细胞A549、肺癌细胞H460、人乳腺癌细胞MCF-7和人肝癌细胞HepG2均有较强的抑制作用,统计学上均具有显著性差异。(4)利用响应面Box-Behnken设计,优化突变菌株M7226的发酵条件,得到最佳发酵条件：发酵温度29℃,初始pH值6.8,发酵时间10 d。在此条件下,经发酵放大和组合分离、纯化方法,从其发酵液中获得5个单体化合物。利用波谱技术并结合理化性质确定5个化合物分别为姜黄素、肉桂酸、1,4-二羟基蒽醌、赤霉酸和山奈酚。(5)MIC法体外检测5个化合物对四种指示菌(E. coli、P. vulgaris、B. subtilis和S. aureus)的抑制作用,结果显示：①姜黄素和1,4-二羟基蒽醌对四种指示菌均有较强的抑制作用,且呈浓度依赖性,其中姜黄素对E. coli、P. vulgaris、B. subtilis和S. aureus的MIC值分别为200、200、200和50 μg/mL;1,4-二羟基蒽醌对E. coli、P. vulgaris、 B. subtilis和S. aureus的MIC值分别为200、400、400和200 μg/mL;②赤霉酸、山奈酚和肉桂酸对四种指示菌抑制作用不显著,MIC值均大于400 μg/mL。(6) Alamar Blue法检测5个化合物对人乳腺癌细胞MCF-7、人非小细胞肺癌细胞A549、肺癌细胞H460和人肝癌细胞HepG2细胞毒性,结果显示：①姜黄素对HepG2、 H460、MCF-7和A549的增殖均具有较强的抑制作用,IC50值分别为14.12、24.65、20.25和16.42μg/mL;②山奈酚的抗肿瘤活性次之,对HepG2、H460、MCF-7和A549的IC50值分别为60.47、90.22、90.95和129.60③当赤霉酸浓度为200作用时间为24 h,对HepG2 μg/mL增殖的抑制率达24.8%；④当肉桂酸浓度为200 μg/mL作用时间为24 h,对A549的抑制率达13.1%；⑤1,4-二羟基蒽醌对四种肿瘤细胞的增殖均有一定的抑制作用,但作用效果相对较弱。(7)利用影像学技术,通过Hoechst33258染色法、AO/EB双荧光染色法及活体细胞在线培养观察人肝癌细胞HepG2经姜黄素作用后细胞形态的变化。Hoechst33258染色结果显示：HepG2细胞质内可见浓染致密的颗粒块状亮蓝色荧光,细胞表现出核质浓缩、核仁破裂等凋亡特征；AO/EB双荧光试验结果表明：HepG2细胞随着药物浓度的增加,细胞变得稀疏,染色质浓缩,细胞核碎裂呈点状,被染成大小不一、致密浓染的橘黄色颗粒；活体细胞在线培养观察结果显示：HepG2细胞皱缩、胞体变小、染色质浓缩成碎片状、质膜下陷包裹核碎片和细胞器,出现凋亡小体；在此过程中未观察到细胞膜的破裂、内容物的释放,表明姜黄素能够促使HepG2细胞凋亡,而不是导致细胞坏死。上述形态学观察结果均表明,经姜黄素作用后的HepG2细胞出现明显的凋亡特征。(8)RT-PCR试验结果表明：经姜黄素作用后的HepG2细胞,Bcl-2基因表达下调、Bax、Caspase 3和Caspase 8基因表达上调,揭示姜黄素可能通过线粒体依赖性和非依赖性两种途径诱导人肝癌细胞HepG2凋亡。
【关键词】：内生真菌 温莪术 超导磁体 诱变 次级代谢产物 结构鉴定 细胞凋亡
【学位授予单位】：南京理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R915
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-14
• 1 绪论14-33
• 1.1 植物内生真菌14-16
• 1.2 内生真菌宿主植物的选择16-17
• 1.3 植物内生真菌活性代谢产物研究进展17-27
• 1.3.1 生物碱类17-19
• 1.3.2 萜类19-20
• 1.3.3 甾体类20
• 1.3.4 醌类20-21
• 1.3.5 酯类21-23
• 1.3.6 黄酮类23-24
• 1.3.7 酚类及有机酸24
• 1.3.8 酮类24-26
• 1.3.9 其他类型26-27
• 1.4 植物内生真菌产活性代谢产物的机制27
• 1.5 微生物诱变27-31
• 1.5.1 物理诱变28
• 1.5.2 化学诱变28-29
• 1.5.3 复合诱变29
• 1.5.4 空间诱变及其地面模拟诱变29-31
• 1.6 研究目的和意义31-32
• 1.7 研究内容32-33
• 2 温莪术内生真菌的分离、鉴定及活性菌株的筛选33-41
• 2.1 实验材料34-35
• 2.1.1 生物材料34
• 2.1.2 主要试剂与培养基34
• 2.1.3 主要仪器34-35
• 2.2 实验方法35-36
• 2.2.1 温莪术内生真菌分离鉴定35
• 2.2.2 活性菌株筛选35-36
• 2.3 结果与讨论36-39
• 2.3.1 温莪术内生真菌分离鉴定36-38
• 2.3.2 活性菌株筛选38-39
• 2.4 小结39-41
• 3 活性菌株EZG0807分子生物学鉴定及其生物学特性研究41-53
• 3.1 实验材料41-43
• 3.1.1 菌株41-42
• 3.1.2 主要试剂与培养基42
• 3.1.3 主要仪器42-43
• 3.2 实验方法43-45
• 3.2.1 活性菌株形态学特征43
• 3.2.2 活性菌株分子生物学鉴定43-44
• 3.2.3 活性菌株生物学特性44-45
• 3.3 结果与讨论45-52
• 3.3.1 活性菌株EZG0807的鉴定45-48
• 3.3.2 活性菌株EZG0807生物学特性48-52
• 3.4 小结52-53
• 4 模拟空间环境诱变内生真菌EZG080753-77
• 4.1 实验材料54-55
• 4.1.1 微生物材料54
• 4.1.2 主要试剂与培养基54-55
• 4.1.3 主要仪器55
• 4.2 实验方法55-62
• 4.2.1 模拟空间环境诱变EZG080755-56
• 4.2.2 高活性突变株的筛选56-57
• 4.2.3 高活性突变株的遗传稳定性检测57
• 4.2.4 高活性突变株与出发菌株的比较57-58
• 4.2.5 AFLP分子标记58-60
• 4.2.6 目的条带的克隆60-62
• 4.3 结果与讨论62-76
• 4.3.1 高活性突变株的筛选62-66
• 4.3.2 突变菌株M7226的遗传稳定性66-67
• 4.3.3 突变菌株M7226与出发菌株EZG0807生物学性质比较67-71
• 4.3.4 模拟空间环境诱变机理探索71-76
• 4.4 小结76-77
• 5 菌株M7226发酵条件优化77-87
• 5.1 实验材料78
• 5.1.1 菌株78
• 5.1.2 主要培养基78
• 5.2 实验方法78-79
• 5.2.1 RSM优化发酵条件78
• 5.2.2 菌株发酵及样品制备78
• 5.2.3 发酵液抑菌活性测定78-79
• 5.3 结果与讨论79-85
• 5.3.1 实验设计方案79
• 5.3.2 二次回归拟合及方差分析79-81
• 5.3.3 最佳发酵条件的确定81-85
• 5.4 小结85-87
• 6 菌株M7226次级代谢产物的分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究87-103
• 6.1 实验材料88-89
• 6.1.1 菌株88
• 6.1.2 主要试剂88-89
• 6.1.3 主要仪器89
• 6.2 实验方法89-93
• 6.2.1 菌株M7226发酵及发酵液的预处理89-90
• 6.2.2 菌株M7226发酵产物的提取与分离90-91
• 6.2.3 化合物结构鉴定91-93
• 6.2.4 最小抑菌浓度测定93
• 6.2.5 细胞抑制率测定93
• 6.2.6 数据统计学分析93
• 6.3 结果与讨论93-101
• 6.3.1 菌株M7226次级代谢产物的结构鉴定94-97
• 6.3.2 单体化合物抗菌活性分析97-99
• 6.3.3 单体化合物抗肿瘤活性分析99-101
• 6.4 小结101-103
• 7 次级代谢产物体外抗肿瘤作用机制探索103-115
• 7.1 实验材料104-105
• 7.1.1 样品104
• 7.1.2 细胞株104
• 7.1.3 培养基及试剂104
• 7.1.4 主要仪器104-105
• 7.2 实验方法105-107
• 7.2.1 荧光显微镜下观察细胞形态105
• 7.2.2 活体细胞在线培养105
• 7.2.3 RT-PCR测定基因表达水平105-107
• 7.2.4 数据统计学分析107
• 7.3 结果与讨论107-114
• 7.3.1 荧光显微镜下HepG2细胞形态107-109
• 7.3.2 活体细胞在线培养109-110
• 7.3.3 HepG2细胞相关基因表达水平110-114
• 7.4 小结114-115
• 8 结论与展望115-118
• 8.1 结论115-117
• 8.2 创新点117
• 8.3 展望117-118
• 致谢118-119
• 参考文献119-139
• 附录139-140
• 攻读博士学位期间所发表的论文139
• 攻读博士学位期间参加与本学位相关的科研课题139-140
• 附图140-144

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