靶向肺癌LunX的CAR-T细胞治疗

发布时间：2021-04-25 05:29

　　肺癌是目前全球高发的癌症之一,它具有高死亡率以及预后差等特点,然而目前针对于肺癌,并没有非常有效的治疗手段。近些年,随着细胞治疗的发展,CAR-T细胞治疗的研究和临床实验也在如火如荼的进行中。CAR-T细胞治疗是将T细胞从病人外周血中分离出来,经过体外的活化后利用慢病毒,逆转录病毒或者电转染等方式对T细胞进行转染,使其能够过表达CAR序列,而后通过一系列的检测和质控,再回输入病人的体内达到靶向杀伤肿瘤的目的。在过去的一些报道和临床实验中,虽然CAR-T细胞对于血液肿瘤有着良好的杀伤效果,但是对于实体肿瘤的治疗一直效果欠佳,主要原因包括:1、肿瘤微环境是一个免疫抑制的环境,存在大量免疫抑制细胞和细胞因子;2、缺乏特异性有效的靶点。前期研究证实肺癌细胞特异性高表达LunX蛋白,且用LunX单克隆抗体S-35-8治疗肺癌小鼠模型取得了很好的疗效,那么制备针对LunX蛋白的CAR-T细胞可能对肺癌也有着很好的治疗效果。基于此,我们展开了对针对LunX抗原的CAR-T细胞研究,并取得了如下结果:1、LunX特异性CAR-T细胞的构建我们使用SPR检测了 LunX蛋白单克隆抗体S-35-8与Lun... 

【文章来源】：中国科学技术大学安徽省 211工程院校 985工程院校

【文章页数】：113 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 绪论
    1.1 细胞治疗的发展
        1.1.1 干细胞治疗
        1.1.2 CIK细胞治疗
        1.1.3 NK细胞治疗
        1.1.4 T细胞治疗
            1.1.4.1 肿瘤浸润T细胞
            1.1.4.2 TCR-T细胞
    1.2 CAR-T细胞治疗
        1.2.1 CAR-T细胞的研究现状
            1.2.1.1 CD28与4-1BB共刺激的比较
            1.2.1.2 第一代CAR-T
            1.2.1.3 第二代CAR-T
            1.2.1.4 第三代CAR-T
            1.2.1.5 第四代CAR-T
        1.2.2 CAR-T治疗血液瘤
        1.2.3 CAR-T治疗实体瘤
            1.2.3.1 CAR-T治疗实体瘤的现状
            1.2.3.2 CAR-T治疗实体瘤面临的挑战
    1.3 肺癌
        1.3.1 导致肺癌的原因
            1.3.1.1 吸烟
            1.3.1.2 氡气
            1.3.1.3 石棉
            1.3.1.4 空气污染
            1.3.1.5 遗传因素
        1.3.2 肺癌的诊断
            1.3.2.1 胸部X光检查
            1.3.2.2 电子计算机体层扫描（CT）
            1.3.2.3 核磁共振（MRI）
            1.3.2.4 痰脱落细胞的检查
            1.3.2.5 纤维支气管检查（纤支镜）
            1.3.2.6 开胸手术检查
            1.3.2.7 其他检查
        1.3.3 肺癌分类
        1.3.4 肺癌相关的基因突变
            1.3.4.1 RAS
            1.3.4.2 MYC
            1.3.4.3 BCL-2
            1.3.4.4 NOTCH-3
            1.3.4.5 AIS
        1.3.5 目前肺癌的治疗方法
            1.3.5.1 手术
            1.3.5.2 放疗
            1.3.5.3 化疗
            1.3.5.4 靶向抗体治疗
        1.3.6 肺癌和LunX
        1.3.7 目前针对于肺癌的CAR-T细胞治疗
第二章 引言
第三章 实验材料与方法
    3.1 实验动物
    3.2 实验材料
        3.2.1 小鼠实验试剂
        3.2.2 人外周血分离相关试剂
        3.2.3 T细胞分离以及活化相关试剂
        3.2.4 细胞系
        3.2.5 细胞培养相关试剂
        3.2.6 流式细胞术相关试剂
        3.2.7 细胞增殖检测相关试剂
        3.2.8 提取RNA以及逆转录PCR相关试剂
        3.2.9 分子克隆技术相关试剂
        3.2.10 转染以及包装浓缩病毒相关试剂
        3.2.11 免疫荧光相关试剂
        3.2.12 蛋白质分子生物学相关试剂
        3.2.13 免疫组化相关试剂
        3.2.14 ELISA相关试剂
    3.3 实验器材
        3.3.1 通用实验器材
        3.3.2 细胞培养实验器材
        3.3.3 分子克隆实验器材
        3.3.4 Western blot实验器材
        3.3.5 动物实验实验器材
        3.3.6 流式细胞术相关器材
        3.3.7 免疫组织化学相关器材
    3.4 实验方法
        3.4.1 细胞分离,复苏,培养和冻存
            3.4.1.1 人外周血T细胞分离
            3.4.1.2 人外周血T细胞培养与活化
            3.4.1.3 细胞系的复苏
            3.4.1.4 贴壁细胞的培养
            3.4.1.5 细胞冻存
            3.4.1.6 Cell trace violet标记细胞
        3.4.2 质粒的提取
        3.4.3 RNA的提取
        3.4.4 逆转录
        3.4.5 PCR
        3.4.6 感受态转化及阳性克隆筛选
        3.4.7 慢病毒的包装、收集以及浓缩
        3.4.8 T细胞的活化以及慢病毒的感染
        3.4.9 Western Blotting
        3.4.10 免疫组化
        3.4.11 RTCA检测杀伤
        3.4.12 流式细胞术
        3.4.13 免疫荧光
        3.4.14 细胞因子的检测
        3.4.15 小鼠模型构建
        3.4.16 提取小鼠基因组DNA
        3.4.17 抗体的制备与纯化
            3.4.17.1 收集杂交瘤细胞培养上清
            3.4.17.2 制备腹水
            3.4.17.3 纯化抗体
        3.4.18 统计分析
第四章 实验结果
    4.1 实验结果
LunX表达载体">        4.1.1 构建CAR^LunX表达载体
LunXT细胞">        4.1.2 慢病毒成功感染CAR^LunXT细胞
LunXT细胞产生细胞因子">        4.1.3 LunX抗原可以刺激CAR^LunXT细胞产生细胞因子
        4.1.4 非小细胞肺癌细胞膜表达LunX蛋白
LunXT细胞可以靶向杀伤非小细胞肺癌细胞">        4.1.5 CAR^LunXT细胞可以靶向杀伤非小细胞肺癌细胞
+细胞可以特异性活化CAR^LunXT细胞效应功能">        4.1.6 LunX⁺细胞可以特异性活化CAR^LunXT细胞效应功能
LunXT细胞抑制肺癌的生长">        4.1.7 CAR^LunXT细胞抑制肺癌的生长
LunXT细胞抑制PDX模型肿瘤的生长">        4.1.8 CAR^LunXT细胞抑制PDX模型肿瘤的生长
    4.2 总结与讨论
参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文与取得的其它研究成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]Chimeric antigen receptor-modified T cells for the immunotherapy of patients with EGFR-expressing advanced relapsed/refractory non-small cell lung cancer[J]. Kaichao Feng,Yelei Guo,Hanren Dai,Yao Wang,Xiang Li,Hejin Jia,Weidong Han.  Science China（Life Sciences）. 2016(05)



本文编号：3158796