Caveolin-1及ERM在TNF-α致大鼠肺微血管内皮细胞高通透性中的作用机制研究

发布时间：2017-04-20 06:05

  本文关键词：Caveolin-1及ERM在TNF-α致大鼠肺微血管内皮细胞高通透性中的作用机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的肺微血管内皮细胞是构成血气屏障的重要结构之一,其通透性的增加是急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)的重要病理生理基础。肺微血管内皮细胞在炎症因子的作用下一方面内皮细胞本身发生水肿,使得血气屏障的厚度增加导致弥散效率下降,另一方面大量炎症细胞发生肺内“扣押”,聚集的炎症细胞发生活化,释放大量炎性介质,这些炎性介质可直接损伤微血管内皮细胞,同时炎症介质可激活更多炎症细胞,从而导致级联放大的炎症效应产生。炎症反应中产生的大量炎症因子可使肺微血管内皮细胞发生凋亡,也可诱导内皮细胞骨架的重组以及细胞间连接蛋白发生改变,从而导致细胞间隙增大,细胞屏障功能受损,细胞单层通透性增加。小窝蛋白(caveolin)作为小窝(caveolae)的结构性蛋白,其脚手架(scaffolding domain)能与多种信号分子结合,从而赋予小窝信号转导枢纽的作用。埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ezrin/radixin/moesin,ERM)组成了ERM蛋白家族,三个蛋白的N端氨基酸序列(FERM)具有高度同源性,并且FERM将细胞骨架F-actin与膜相蛋白相连,从而调节多种信号通路,如细胞迁移、生长和粘附等。ERM的活化主要通过其C端的结构域与自身或者另外一个单体的FERM结构域相结合,形成单聚体或者同源、异源二聚体。这种分子间的相互作用导致的头尾相连,掩盖了ERM蛋白中膜蛋白和骨架蛋白的结合位点,从而使ERM处于失活状态。本研究拟通过观察抑制caveolin-1的表达对TNF-α致RPMVECs单层高通透性的调节以及对RPMVEC骨架重组和ERM磷酸化的影响,探讨caveolin-1的作用;再通过抑制moesin的表达初步研究moesin在TNF-α致伤RPMVECs中的作用。方法1.体外分离、培养原代RPMVECs并鉴定。2.利用transwell分别构建体外caveolin-1低表达和正常表达的RPMVECs单层细胞模型。按照相应的实验分组给予不同的刺激后检测跨内皮细胞电阻(transendothelial electrical resistance,TER)变化和对牛血清白蛋白的通透性变化。3.利用激光共聚焦显微镜观察RPMVECs在给予不同药物刺激后骨架蛋白F-actin和磷酸化ERM的变化。4.通过western blot检测不同实验分组中ERM磷酸化水平改变。5.构建靶向moesin的载体质粒,并包装相应慢病毒感染RPMVECs下调moesin的表达。6.分别检测moesin低表达和正常表达的RPMVECs构建的细胞单层受到TNF-α刺激后TER的改变。结果1.体外成功分离培养RPMVECs,经形态学、FITC-植物血凝素结合试验和CD34染色证实。2.原代RPMVECs感染慢病毒后48小时在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白(GFP)表达72小时后GFP表达强度进一步增大。感染caveolin-1-sh RNA lentivirus的RPMVECs总caveolin-1表达于感染后48小时开始降低,72小时达到最低值,约为初始的21±6%。阴性对照组caveolin-1表达无显著变化。3.Caveolin-1低表达的细胞单层模型正常状态下TER较阴性对照组TER略有升高,但差异无统计学意义。所有给予刺激的组别其TER于15min开始降低,3小时降低至最大值。抑制caveolin-1表达能够减轻TNF-α和PKC激动剂PMA诱导的TER降低。低表达caveolin-1的细胞单层预先给予PKC抑制剂BIM作用2小时再给予TNF-α刺激相对于给予同样处理的caveolin-1表达正常细胞单层,其电阻降低进一步减轻。总的来说PKC抑制剂BIM可减轻TNF-α导致的跨细胞单层电阻降低,抑制caveolin-1表达后可在此基础上进一步减轻但仍然低于正常组。TNF-α和PMA作用RPMVECs 4h后,RPMVECs单层对FITC-BSA通透性增加至阴性对照组的8倍。PKC抑制剂BIM显著降低TNF-α致RPMVECs单层对FITC-BSA的通透性,但仍然高于正常对照组。4.未给予任何刺激的RPMVECs中,F-actin主要分布于细胞外周近细胞膜处;未见F-actin聚集为粗大的张力纤维。同时细胞内可检测到少量磷酸化ERM表达,均匀弥散分布于整个细胞内,并且RPMVECs感染慢病毒和下调caveolin-1的表达对RPMVECs中F-actin以及ERM的磷酸化水平影响不明显,与正常对照组(normal组)无明显差异。5.给予低表达caveolin-1的RPMVECs TNF-α刺激2h后,F-actin较正常组(control-sh RNA组)形成增加,但与阴性对照刺激组(control-sh RNA+TNF-α组)相比,F-actin形成显著减少,跨细胞应力纤维形成不明显;ERM磷酸化水平增加程度不及正常组(control-sh RNA组)但较阴性对照刺激组(control-sh RNA+TNF-α组)明显减少。6.PKC激动剂PMA作用于caveolin-1正常表达的RPMVECs后可见F-actin聚集,应力纤维形成,ERM磷酸化显著增加(与normal组相比),而PMA作用于抑制caveolin-1表达的RPMVECs后应力纤维形成明显减少,ERM磷酸化亦显著降低。在caveolin-1表达正常的RPMVECs中抑制PKC的活化仍可见TNF-α所至的F-actin的聚集和应力纤维的形成,但ERM磷酸化显著降低(与control-sh RNA+TNF-α组相比)。7.成功构建三个重组pLL3.7-moesin载体质粒,并且包装为相应慢病毒,经浓缩后滴度依次为109TU/ml、109TU/ml、3×109 TU/ml。三个靶位点对moesin表达抑制效率分别为61.5±11.2%、53.6±8.5%、76.1±3.8%。8.RPMVECs在正常情况下即有少量磷酸化ERM表达,TNF-α作用2小时后ERM磷酸化显著增加,PKC抑制剂BIM可抑制TNF-α介导的ERM磷酸化。抑制caveolin-1的表达可显著降低TNF-α介导的ERM磷酸化,同时BIM在caveolin-1低表达的RPMVECs中抑制TNF-α介导的ERM磷酸化作用不显著。9.抑制moesin表达可减轻TNF-α介导的RPMVECs单层通透性增高。结论1.Caveolin-1可通过调节PKC活性减轻TNF-α致大鼠肺微血管内皮细胞单层通透性的增高。2.TNF-α致大鼠肺微血管内皮细胞骨架重组及ERM磷酸化增加部分依赖于caveolin-1的存在。3.成功构建moesin低表达大鼠肺微血管内皮细胞模型。4.抑制moesin表达可减轻TNF-α致大鼠肺微血管内皮细胞单层通透性的增高。
【关键词】：肺微血管内皮细胞 小窝蛋白-1 埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白 通透性 细胞骨架 RNA干扰
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R563.8
【目录】：

• 中英文缩略词对照6-8
• 中文摘要8-12
• 英文摘要12-17
• 第一部分 Caveolin-1通过作用于PKC参与TNF-α致大鼠肺微血管内皮细胞单层通透性增高的调控机制17-41
• 1 引言17-18
• 2 材料与方法18-32
• 2.1 实验材料18-20
• 2.1.1 实验动物18
• 2.1.2 主要试剂及耗材18-20
• 2.2 实验方法20-30
• 2.2.1 试剂配制20-24
• 2.2.2 RPMVECs分离培养24-25
• 2.2.2.1 原代RPMVECs细胞培养24-25
• 2.2.2.2 RPMVECs的消化传代25
• 2.2.3 RPMVECs鉴定25-26
• 2.2.3.1 RPMVECs生长形态观察25
• 2.2.3.2 CD34相关抗原鉴定25-26
• 2.2.3.3 植物凝血素结合实验26
• 2.2.4 Western blot26-29
• 2.2.5 RPMVECs通透性检测29-30
• 2.3 实验方案30-31
• 2.4 统计学处理31-32
• 3 结果32-38
• 4 讨论38-41
• 第二部分 Caveolin-1对TNF-α诱导大鼠肺微血管内皮细胞骨架蛋白及骨架结合蛋白形态学改变的影响41-53
• 1 引言41-42
• 2 材料与方法42-46
• 2.1 实验材料42-43
• 2.2 实验方法43-45
• 2.3 实验分组45-46
• 3 结果46-50
• 4 讨论50-53
• 第三部分 Caveolin-1及ERM在TNF-α致大鼠肺微血管内皮细胞单层通透性增高中的信号转到机制53-71
• 1 引言53-54
• 2 材料与方法54-64
• 2.1 实验材料54-56
• 2.2 实验方法56-63
• 2.3 实验分组63
• 2.4 统计学处理63-64
• 3 结果64-69
• 4 讨论69-71
• 全文结论71
• 参考文献71-76
• 附录76-78
• 致谢78-79
• 综述79-84
• 参考文献82-84

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