调节性T细胞在中枢神经系统损伤中的作用研究

发布时间：2017-04-20 10:09

  本文关键词：调节性T细胞在中枢神经系统损伤中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景免疫炎症反应是创伤性中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)损伤中继发损伤的重要因素,贯穿继发损伤的始终。过去十多年随着神经免疫学的发展,免疫反应在中枢神经系统中的作用得到了广泛的研究,但并未得出一致性的结论。传统的观点认为CNS是免疫豁免器官,任何浸润其中的外周免疫细胞都是有害的,应当予以抑制以减轻继发损伤[1];而其它研究发现CNS损伤后主动或被动用CNS自身抗原免疫动物提高自身免疫T细胞的数量和活性都能明显增加损伤后神经元的存活,促进神经功能的恢复[2],但具有这种保护作用的T细胞的具体亚型仍不清楚。调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)是一类自然产生的能控制体内自身免疫反应的T细胞亚群,表达转录因子Foxp3,对自身抗原有很高的亲和力,通过直接接触或分泌抗炎因子IL-10,TGFβ等抑制T细胞的增殖和活化[3]。近年对调节性T细胞的研究主要集中在肿瘤和自身免疫性疾病中,CNS损伤后Treg细胞的作用及其机制,以及其对于CNS损伤后免疫反应的作用如何尚不清楚。免疫反应按参与的细胞和反应时序不同可分为固有免疫反应和适应性免疫反应,二者之间相互联系,相互作用,共同维持机体内环境稳定。巨噬细胞是机体一大类重要的固有免疫细胞,在损伤修复过程中起着重要的作用。CNS损伤后损伤区有两种不同来源的巨噬细胞,一种是CNS固有的小胶质细胞活化产生,一种是血液单核细胞浸润至损伤区产生,这两种细胞在形态和表面标记上目前都无法区分,因此被统称为巨噬/小胶质细胞[4],但它们在损伤后的具体作用是否完全一致仍有待研究。巨噬细胞在不同的细胞因子环境下能向不同方向极化,进而产生不同的作用。在LPS和IFN-γ存在的条件下细胞通过经典活化途径向M1方向活化,产生TNFα和IL-1β等促炎因子,并高表达诱导型一氧化氮合梅(i NOS),产生大量氧自由基。而在IL-4和IL-13的作用下,细胞则向M2方向活化,产生IL-10和TGFβ等抗炎因子,并高表达精氨酸酶1(arginase1)同i NOs竞争底物精氨酸,能促进细胞增殖和组织重塑[5]。研究显示CNS损伤后而M2型活化的巨噬细胞有神经保护作用[6]。但具体是何种因素诱导和维持巨噬细胞的这种表型现在仍不清楚。目的1.研究CNS损伤后的免疫反应类型;2.研究调节性T细胞在CNS损伤中的作用及其机制;3.观察CNS损伤后损伤区小胶质细胞来源的巨噬细胞和血液单核细胞来源的巨噬细胞之间的差异,及其对损伤恢复的影响。方法1.采用视神经夹伤模型,计数荧光金逆行标记的视网膜节细胞(retinal ganglion cell,RGC),采用脊髓中度撞击伤模型(100k Dy),用BMS(Basso Mouse Scale)标准评估小鼠后肢运动功能恢复的情况;2.给予地塞米松腹腔注射抑制免疫反应观察其对CNS损伤后神经元存活和神经功能恢复的影响,摘除CNS引流淋巴结,观察其对视神经损伤后RGC存活的影响;3.流式细胞术检测CNS损伤后不同淋巴结内CD4+T细胞(CD45+TCRβ+CD4+),CD8+T细胞(CD45+TCRβ+CD8+),调节性T细胞(CD45+TCRβ+CD4+CD25+Foxp3+),效应T细胞(CD45+TCRβ+CD4+CD25+Foxp3-)的数量和比例;4.清除调节性T细胞的方法:采用CD25单克隆抗体(克隆号:PC61)腹腔注射,或采用DEREG转基因小鼠(在foxp3基因启动子下带有白喉毒素受体基因)腹腔注射白喉毒素以清除表达foxp3和白喉毒素受体的调节性T细胞;5.增加调节性T细胞的方法:尾静脉回输体外全反式视黄酸(all-trans retinoic acid,ATRA)和TGF-β诱导培养的调节性T细胞;6.采用嵌合体小鼠(UBC-GFP小鼠的骨髓移植进辐照过的野生型小鼠体内,血液来源的细胞均表达GFP,而CNS固有的小胶质细胞不表达GFP),CCR2 KO小鼠以及CCR2-RFP转基因小鼠观察CNS损伤区巨噬细胞arginase-1的表达情况;7.免疫组织化学染色检测损伤区CD4+T细胞,CD11b+巨噬细胞,Foxp3+细胞的数目,以及arginase-1的表达情况;8.q PCR检测损伤区炎症因子,arginase-1,以及nos2等基因的表达情况;结果1.视神经损伤后,颈深淋巴结内CD4+T细胞比例和数目均明显增多而CD8+T细胞比例降低,颈深淋巴结内调节性T细胞和效应T细胞的比例相对于损伤后皮肤引流淋巴结以及未损伤组的颈深淋巴结均升高。颈深淋巴结内CD4+T细胞IL-4表达增多,能促使体外培养的骨髓来源巨噬细胞表达arginase-1;2.摘除颈深淋巴结小鼠视神经损伤后RGC存活明显减少;地塞米松抑制免疫反应,其处理组视神经损伤后RGC的存活明显少于对照组,其脊髓损伤后后肢运动功能BMS评分也明显低于对照组,3.调节性T细胞对CNS损伤的作用有剂量差异效应,即用25μg PC61抗体或4μg/kg白喉毒素少量清除调节性T细胞能明显增加存活的神经元数目,而用250μg PC61或40μg/kg白喉毒素大量或完全清除调节性T细胞则产生相反的作用。实验中神经元的存活同损伤区arginase-1的表达相关,即低剂量清除调节性T细胞使损伤区arginase-1的表达明显增加,而大量清除调节性T细胞后视神经损伤区arginase-1的表达明显减少;4.静脉回输体外诱导培养的调节性T细胞能明显减少视神经损伤后视网膜节细胞的存活,同时其损伤区表达arginase-1的巨噬细胞比例减少,且损伤区抗炎因子IL-10的表达也明显减少;5.嵌合体小鼠CNS损伤后损伤区arginase-1+的细胞大部分都为GFP+,CCR2 KO小鼠CNS损伤后损伤区缺乏arginase-1+的细胞,且CCR2-RFP小鼠脊髓损伤后损伤区arginase1+的细胞多为RFP+;6.CCR2 KO小鼠在视神经损伤后视网膜节细胞的存活以及脊髓损伤后运动功能的恢复方面均明显差于野生型小鼠。结论1.CNS损伤后外周的免疫反应主要发生在其引流淋巴结颈深淋巴结内,表现为以CD4+T细胞为主导的免疫反应,调节性T细胞和效应T细胞均有增加,并且这种免疫反应具有神经保护作用;2.调节性T细胞对CNS损伤后的保护性免疫反应具有抑制作用,增加调节性T细胞能抑制免疫反应对CNS损伤的保护作用;而适当减少调节性T细胞的数目,减轻其对保护性免疫反应的抑制,能提高CNS损伤后神经元的存活,但过分减少调节性T细胞可能使免疫反应过度活化而产生相反的作用,提示临床上应用调节性T细胞治疗CNS损伤应尤为谨慎;3.CNS损伤后调节性T细胞并不进入损伤区,而可能是在外周直接或间接作用于单核细胞,改变进入损伤区的单核巨噬细胞的极化状态而发挥其作用的;4.CNS损伤后损伤区arginase-1主要表达在血源性单核细胞来源的巨噬细胞上,而小胶质细胞几乎不表达arginase-1,且单核细胞来源的巨噬细胞具有神经保护作用。
【关键词】：CNS损伤 调节性T细胞 保护性自身免疫反应 巨噬细胞 精氨酸酶1
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R741
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-17
• 前言17-20
• 文献回顾20-32
• 第一部分 CNS损伤后的保护性免疫反应32-49
• 1 材料32-33
• 2 方法33-38
• 3 结果38-47
• 3.1 CNS损伤后外周的免疫反应变化38-43
• 3.2 CNS损伤后的免疫反应具有神经保护作用43-47
• 4 讨论47-49
• 第二部分 调节性T细胞对中枢神经系统损伤恢复的影响及其机制49-75
• 1 材料49-50
• 2 方法50-55
• 3 结果55-72
• 3.1 减少调节性T细胞数目对CNS损伤的影响55-66
• 3.2 外源性调节性T细胞抑制CNS保护性免疫反应66-72
• 4 讨论72-75
• 第三部分 CNS损伤区不同来源巨噬细胞ARGINASE-1 的表达75-84
• 1 材料75
• 2 方法75-76
• 3 结果76-83
• 3.1 CNS损伤区arginase-1 主要表达在血液单核细胞来源的巨噬细胞上76-82
• 3.2 血源性巨噬细胞具有神经保护作用82-83
• 4 讨论83-84
• 小结84-85
• 参考文献85-98
• 附录98-99
• 个人简历和研究成果99-100
• 致谢100

【共引文献】

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本文编号：318432