PHF19在人肝细胞癌发病机制中的作用及其受MiR-195-5p调节的机制研究

发布时间：2017-04-20 11:12

  本文关键词：PHF19在人肝细胞癌发病机制中的作用及其受MiR-195-5p调节的机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,包括原发性肝癌和转移性肝癌。目前在全球范围内,肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占原发性肝癌的70%-85%,在男性癌症致死率中排名第三位。尤其在亚洲和非洲国家地区,HCC是肿瘤导致死亡的主要因素之一。病程以恶性程度高,发展较快为特点,已成为严重威胁着人类健康和生命的重要疾病。而对于HCC的发病机制的研究尚未完全明确,因此,探讨HCC的发病机制将为抗肿瘤治疗提供重要的理论依据。HCC通常是由病毒性感染(如乙肝病毒hepatitis B virus, HBV;丙肝病毒hepatitis C virus, HCV)所导致的肝硬化,酒精滥用,代谢紊乱,致癌物(如亚硝胺),黄曲霉菌等因素发展而来。HCC具有特异的病原学和分子学特征,对治疗存在着多样性反应。而多种致癌因素引起的HCC的多样性特征,可能与基因突变及染色体不稳定性所引起的基因学和表观遗传学改变密切相关。研究证实HCC的发生是一个多步骤、多基因、多途径的复杂阶段过程。近年来遗传基因突变、表观遗传学的改变、信号通路异常激活成为阐述HCC发病机制中的热点。其中表观遗传学是指DNA序列本身以外的遗传信息,一些潜在的表观遗传调控机制,主要有DNA甲基化、组蛋白修饰和miRNA调节等。表观遗传学的研究内容主要包括在基因转录过程中和转录后的调控发生变化,主要包括DNA甲基化,组蛋白的共价修饰、染色体重塑、非编码RNA,微小RNA (microRNA, miRNA)等。因此,深入研究HCC发病机制中的分子生物学相关调控,对明确HCC的诊断及寻找新的治疗靶点都具有非常重要的意义。多梳蛋白家族(Polycomb group protein, PcG)是一类在染色质水平上通过表观遗传修饰作用调控靶基因的转录因子,PcG通常以多梳蛋白复合体(Polycomb repressive complex, PRC)的形式存在,目前研究的较多的是多梳蛋白抑制复合物1(Polycomb repressive complex1, PRC1)和多梳蛋白抑制复合物2 (Polycomb repressive complex2, PRC2), PRC主要参与表观遗传修饰的启动和维持,进而调控靶基因表达。PRC在生物体的不同生长阶段中发挥重要作用,包括细胞分化、维持细胞特性、增殖及干细胞重塑,其主要功能是使下游靶基因转录受到抑制进而导致转录沉默。PHD锌指蛋白19 (PHD finger protein 19, PHF19)是PRC2中的重要成员之一,有研究认为PHF19可通过自身Tudor区域结合于H3赖氨酸36位点,参与染色体活化；还有研究表明PHF19在肿瘤发生发展过程中同样具有非常重要的作用,PHF19在多种肿瘤中表达上调,Ghislin等证明PHF19在黑色素瘤中可减少细胞增殖率。Li等研究证明PHF19在胶质瘤细胞中表达上调且与星形胶质瘤细胞分级呈正相关。这些研究结果都表明,PHF19在不同的肿瘤类型中存在高表达,且与肿瘤的侵袭性有着密切关系,可能参与肿瘤的发生发展过程。微小RNA (microRNA, miRNA)是一类长度为17-25个核苷酸的非编码RNA,通过与信使RNA (messenger RNA, mRNA) 3'UTR端或特异序列结合,而调节mRNA稳定性或抑制其转录而参与多种生物学功能。大量研究表明,miRNA参与到许多肿瘤的发生发展过程。改变miRNA水平可引起参与肿瘤生物学作用的相关基因发生变化。近期有研究表明,miR-195在多种肿瘤如肝癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和肾上腺皮质癌等肿瘤组织中表达下调,在裸鼠中过表达miR-195可以显著抑制肿瘤的形成。另有研究表明显示,miR-195可调节人肝癌细胞G1/S期的转化并抑制肿瘤的发生。然而,miR-195与PHF19之间是否存在相互作用,二者是否在HCC发生发展过程中发挥一定的作用尚未明确。因此,为探讨参与HCC发生发展过程中的信号通路的相关调节机制,我们在本课题选择miR195和PHF19作为研究对象。深入探讨其分子生物学特性,及对肝癌细胞及组织的功能学的影响,阐述其具体调控机制。综上所述,本课题旨在研究和探讨miR-195是否对PHF19有调控作用,阐述miR-195对HCC发生发展过程中分子生物学机制的影响,主要从细胞分子水平和动物整体水平观察PHF 19及调控其表达的miRNA对HCC的影响并探讨其相关的机制,为寻找HCC新的治疗靶点提供重要依据。方法一、观察HCC组织中PHF19的表达情况1.首先收集30例临床HCC癌症组织和配对癌旁组织标本,选取癌旁组织为对照组,癌组织为实验组。对组织进行RNA提取,通过实时荧光定量PCR分别检测30例人HCC癌组织和配对癌旁组织中PHF19 mRNA水平的表达。二、观察PHF19对肝癌细胞系的增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响1 通过构建PHF19慢病毒过表达载体,并将载体转染到肝癌细胞系HepG2细胞中,并利用蛋白印迹实验(Western blot)对提取的细胞蛋白质进行分析,验证其慢病毒PHF19载体的转染效果。2.观察的实验组与对照组的HepG2细胞通过Transwell膜的数量,观察PHF19对肝癌细胞侵袭及迁移能力的影响。3.利用CCK-8试剂处理铺板于96孔板的LV-PHF 19 HepG2细胞和LV-Mock HepG2细胞,检测二者的细胞增殖效果的差异,观察PHF19对HepG2细胞增殖效率的影响。4.对培养的LV-PHF 19 HepG2细胞和LV-Mock HepG2细胞进行收集,固定,染色后在流式细胞仪上进行检测,观察PHF19对细胞周期和凋亡的调控作用。三、观察内源性miRNA miR-195-5p对PHF19的调控作用1.通过生物信息学网站(TargetScan, miRanda, RNA22, miRDB, miR-Gen, PITA, EMBL-EBI, starBase, PicTar, RNAhybrid and miRBase)分析与PHF19特定序列靶向结合的miRNAs,并通过荧光素酶报告试验验证结合位点。2.在HepG2细胞中转染miR-195-5p mimic,通过蛋白印迹实验(Western blot)检测PHF19蛋白水平表达情况。3.通过收集30例临床HCC病人癌组织和配对癌旁组织标本,利用RT-RCR检测组织中miR-195-5p表达情况。四、观察miR-195-5p对肝癌细胞系的增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响1.通过构建miR-195-5p慢病毒过表达载体,并将载体转染到肝癌细胞系HepG2细胞中。用Transwell小室观察过表达miR-195-5p HepG2的处理组细胞与对照组细胞的侵袭及迁移作用的差异。观察miR-195-5p对HepG2细胞侵袭性的影响。2.利用CCK-8试剂处理铺板于96孔板的LV-miR-195-5p HepG2细胞和LV-Mock HepG2细胞,检测二者的细胞增殖率的差异,观察miR-195-5p对HepG2细胞增殖效率的影响。3.对培养的LV-miR-195-5p HepG2细胞和LV-Mock HepG2细胞进行收集,固定,染色后在流式细胞仪上进行检测,观察miR-195-5p对细胞周期和凋亡的调控作用。五、观察PHF19和miR-195-5p对裸鼠成瘤作用的影响1.分别将处理组LV-PHF19HepG2细胞、LV-miR-195-5p细胞HepG2,对照组LV-Mock HepG2细胞配置成细胞悬液,注射到裸鼠体内,喂养并每3天称重,2周后解剖肿瘤组织进行称重,观察PHF19及miR-195-5p的对成瘤效果的影响。六、统计学分析所有计量资料结果均用均数±标准差(x±S)表示。qPCR检测PHF19在HCC癌组织和配对癌旁组织实验和裸鼠成瘤实验结果采用配对的t检验,对细胞增殖能力和细胞周期影响的实验结果采用析因设计的方差分析,对PHF19蛋白表达结果采用单因素方差分析,其它的两两比较的结果采用独立样本t检验；采用SPSSv13.0统计软件包进行数据分析,统计结果以P0.05为差异具有统计学意义。结果一、观察HCC癌组织中PHF19的表达情况1.收集南方医院临床30例肝癌癌症组织和配对癌旁组织标本,选取癌旁组织为对照组,癌组织为处理组。提取组织RNA,通过RT-PCR分别检测组织中PHF19的mRNA表达水平。结果显示,与癌旁组织相比,PHF19在癌组织表达显著上调(t=-3.909,P=0.001),有统计学意义。二、观察PHF19对肝癌细胞系的增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响1.本研究通过构建过表达PHF19的慢病毒包装质粒载体,并将载体转染到肝癌细胞系HepG2细胞,同时设立实验组LV-PHF19 HepG2细胞及对照组LV-Mock HepG2细胞,提取转染PHF19的肝癌细胞株中的总蛋白,并利用蛋白免疫印迹技术(Western blot)对提取的细胞蛋白质进行转染效果验证,结果显示：PHF19过表达的肝癌细胞组转染效果显著高于对照组,组间对比有显著性差异(F=50.43,P0.001),有统计学意义。2.利用经典的Transwell小室实验,观察稳定过表达PHF19的肝癌细胞株侵袭性是否受到增强。结果显示,与阴性对照组比较,稳定过表达PHF19后肝癌细胞的侵袭和转移能力都显著增强,组间比较具有统计学意义(invasion: t=-8.736,P0.001; migration:t=-20.476, P0.001)。3.通过CCK-8增殖实验,我们发现,与阴性对照组相比,过表达PHF19可提高肝癌细胞的增殖能力,24小时(F=13.958,P=0.001)和48小时(F=20.582,P0.001)细胞增殖能力都显著增高,有统计学意义。4.通过流式细胞术检测PHF19过表达后对肝癌细胞周期和凋亡的影响。结果显示,与LV-Mock HepG2细胞相比,LV-PHF19 HepG2细胞处于G1期细胞数目减少(F=263.311,P0.001),有统计学意义；处于S期细胞数目增多(F=249.19,P0.001),有统计学意义；而G2M期无显著性差异(F=0.175,P=0.679),没有统计学意义。同时凋亡检测结果显示：与LV-Mock HepG2细胞相比,LV-PHF19 HepG2细胞的细胞凋亡比率明显减少(t=-11.724,P0.001),有统计学意义。表明PHF19在HCC病理过程中具有重要作用。三、观察调控肝癌过程中PHF19的内源性miRNA1.为进一步研究与PHF19结合的miRNA,我们通过生物信息学网站(TargetScan, miRanda,RNA22, miRDB, miR-Gen, PITA, EMBL-EBI, starBase, PicTar, RNAhybrid and miRBase)分析与PHF19靶向结合的miRNAs,并通过荧光素酶报告实验验证结合位点,结果显示PHF19的3'UTR与miR-195-5p区存在互补配对序列。2.在HepG2细胞中转染has-miR-195-5p mimic,通过蛋白印迹实验(Western blot)检测PHF19蛋白水平表达情况。结果显示,与对照组相比,has-miR-195-5p可明显下调PHF19的蛋白水平表达,两组有统计学差异(F=32.033,P0.001)。3.对所收集临床30例HCC病人癌组织和配对癌旁组织标本,提取其RNA,利用RT-RCR检测miR-195-5p基因水平表达情况,结果显示癌组织中miR-195-5p表达显著低于对照组(t=6.67,P=0.001),有统计学意义。验证了miR-195-5p与PHF19表达呈相反变化趋势。四、观察miR-195-5p对肝癌细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡的影响1.构建miR-195-5p慢病毒过表达载体,并将载体转染到肝癌细胞HepG2中。通过Transwell实验,发现与对照组相比,过表达miR-195-5p可显著抑制肝癌细胞的体外侵袭(t=11.490,P0.001)和转移能力(t=11.355,P0.001),有统计学意义。2.增殖实验结果显示,相对于对照组,过表达miR-195-5p后24小时HepG2细胞的增殖活力(F=13.489,P=0.001)和48小时(F=16.988,P=0.000)细胞增殖能力均有显著下降,有统计学意义(P0.05)。3.过表达miR-195-5p后,与对照组细胞相比,处于G1期细胞增多(F=37.759,P=0.000),处于S期细胞减少(F=32.710,P=0.000),均有显著性差异,有统计学意义。凋亡检测结果显示：与对照组细胞相比, LV-has-miR-195-5p HepG2细胞的细胞凋亡率显著增加(t=11.728,P0.001),有统计学意义。五、观察PHF19和miR-195-5p对裸鼠成瘤作用的影响1.与体外细胞实验结果相一致,体内动物实验结果表明,注射表达慢病毒空载载体肝癌细胞的对照组中裸鼠体内瘤块并未明显变化,而注射PHF19过表达的肝癌细胞成瘤作用显著高于对照组(t=6.14,P0.001),注射miR-195-5p过表达组肝癌细胞则成瘤作用显著低于对照组(t=-4.552,P0.001),均有统计学意义。以上结果表明：PHF19具有成瘤作用,而miR-195-5p具有抑瘤作用。结论1.PHF19在肝癌组织中表达明显高于配对癌旁组织,与肝癌发展相关。2.过表达PHF19可明显促进肝癌细胞的增殖、迁移和生长,并抑制细胞凋亡;3.miR-195-5p通过靶向调控PHF19的转录,并下调PHF19的表达；4. miR-195-5p在肝癌组织中表达明显低于配对癌旁组织,过表达miR-195-5p可明显抑制肝癌细胞的增殖、迁移和生长,并诱导细胞凋亡；5.动物实验证实PHF19在肝癌中具有成瘤作用,miR-195-5p则具有抑瘤作用。创新点设计具有PHF19差异表达的细胞,检测其对细胞功能学的影响,首次证实了过表达PHF19具有明显促进肝癌细胞侵袭和生长的能力。通过生物信息学预测,首次发现能靶向作用于PHF19的是miR-195-5p。设计具有miR-195-5p差异表达的细胞,检测其对PHF19表达的影响,并证实miR-195-5p对细胞增殖及生长的抑制作用是通过靶向抑制PHF19表达而实现。通过体外细胞和体内动物成瘤实验,证实了受肿瘤抑制因子miR-195-5p所调节的PHF19具有促进HCC发生的作用。这些研究将进一步说明miR-195-5p和PHF19有望作为HCC的治疗靶标。
【关键词】：PHF19 miR-195-5p HCC 增殖 凋亡
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 前言22-37
• 材料和方法37-58
• 1 实验材料37-39
• 2 实验方法39-57
• 3 统计学分析57-58
• 实验结果58-79
• 1 PH19对肝癌细胞功能的影响58-59
• 2 PHF19对肝癌细胞生长的影响59-66
• 3 miRNA-195-5p对PHF19表达影响的研究66-70
• 4 miR-195-5p对肝癌细胞功能的影响70-77
• 5 PHF19和miRNA-195-5p对裸鼠肝癌形成的机制研究77-79
• 讨论79-91
• 全文小结91-92
• 参考文献92-110
• 附录110-111
• 缩略词简表111-113
• 致谢113-116
• 统计学审稿证明116

  本文关键词：PHF19在人肝细胞癌发病机制中的作用及其受MiR-195-5p调节的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：318540