胚胎干细胞经外胚层向髁突软骨干细胞定向分化及其软骨损伤修复应用研究
发布时间：2021-06-01 02:43
研究背景颞下颌关节（temporomandibular joint,TMJ）髁突“软骨退变”是众多TMJ疾病的共有病理特征,可导致软骨下骨破坏吸收,引起TMJ疼痛、张口受限等关节症状。由于软骨为无血管的组织,一旦发生损伤或破坏,其修复极为困难。通过干细胞向软骨细胞定向分化进而修复损伤的软骨细胞已成为当前研究的重点。目前常用的种子细胞主要包括以下几种:骨髓基质干细胞（bone marrow stroma stem cells,BMSCs）、胚胎干细胞（embryonic stem cells,ESCs）等。尽管BMSCs向软骨分化的技术已经较为成熟,但由于其来源于中胚层的细胞特性及有限的增殖能力和多向分化等不可控因素,限制了BMSCs在修复关节软骨尤其是TMJ关节软骨方面的应用。而ESCs向关节软骨分化虽已得到越来越多学者的认可,但这些技术绝大多数通过中胚层诱导而来,与TMJ的发育过程并不相符。其原因在于,在胚胎发育过程中,TMJ起源于神经外胚层而非中胚层。研究目的本研究拟模拟TMJ髁突软骨发育过程,诱导ESCs经神经外胚层分化成软骨干细胞,并从体内、外检测软骨干细胞的自我更新特性及分化...
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：99 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
胚胎干细胞免疫荧光染色（标尺：100μm）
图 1. 胚胎干细胞免疫荧光染色（标尺：100μm）。A. 胚胎干细胞 OCT4 免疫荧光染色。 B. 胚胎干细胞 SOX2 免疫荧光染色。Figure 1. Immunofluorescence staining of embryonic stem cells . A. Immunofluorescencestaining of OCT4. B. Immunofluorescence staining of SOX2. (bar 100μm )
上海交通大学医学院博士论文161.3.2诱导分化过程中多能干细胞标志变化规律对ESCs、诱导分化不同阶段的细胞分别收集其RNA，检测全能干细胞标志物OCT4、SOX2和NANOG的表达情况。结果显示，以ESCs为参考，在外胚层诱导分化培养基诱导后各时间点3天、6天、16天和更换软骨干细胞扩增培养基后12天，OCT4、SOX2和NANOG均无表达（图3）。两种不同胚胎干细胞系H1和Hues9较为一致。图3.诱导过程中OCT4、SOX2和NANOG的表达（*表示与胚胎干细胞比，P<0.05；**表示与胚胎干细胞比，P<0.01）。Figure3.theexpressionofOCT4、SOX2andNANOGduringinductionprocess（*meanscomparedwithESCs，P<0.05；**meanscomparedwithESCs，P<0.01）.1.3.3诱导过程各个胚层标志物变化规律随后，我们对诱导过程各阶段细胞的RNA采用RT-PCR方法检测了外胚层（NESTIN、ALCAM、ANPEP）、中胚层（CD19、CD45、TNN2）和内胚层（GATA4、GATA6、SOX7）主要标志物的表达情况。我们发现，更换软骨干细胞扩增培养基后外胚层标志物在诱导末期表达都升高，与诱导前的ESCs相比，差异具有统计学意义；而中胚层和内胚层的标志物，除了H1细胞系的Tnn2在诱导末期增高外，其他基因几乎都没有表达（图4）。随后我们对诱导各个阶段的细胞进行深度测序，并从中筛选出更多各个胚层的标志基因。通过比较诱导后细胞与ESCs各胚层基因的表达差异，我们发现外胚层标志基因在诱导完成后的细胞中普遍高表达，而中、内胚层的基因表达则显著降低（图5）。
本文编号：3209506
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：99 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
胚胎干细胞免疫荧光染色（标尺：100μm）
图 1. 胚胎干细胞免疫荧光染色（标尺：100μm）。A. 胚胎干细胞 OCT4 免疫荧光染色。 B. 胚胎干细胞 SOX2 免疫荧光染色。Figure 1. Immunofluorescence staining of embryonic stem cells . A. Immunofluorescencestaining of OCT4. B. Immunofluorescence staining of SOX2. (bar 100μm )
上海交通大学医学院博士论文161.3.2诱导分化过程中多能干细胞标志变化规律对ESCs、诱导分化不同阶段的细胞分别收集其RNA，检测全能干细胞标志物OCT4、SOX2和NANOG的表达情况。结果显示，以ESCs为参考，在外胚层诱导分化培养基诱导后各时间点3天、6天、16天和更换软骨干细胞扩增培养基后12天，OCT4、SOX2和NANOG均无表达（图3）。两种不同胚胎干细胞系H1和Hues9较为一致。图3.诱导过程中OCT4、SOX2和NANOG的表达（*表示与胚胎干细胞比，P<0.05；**表示与胚胎干细胞比，P<0.01）。Figure3.theexpressionofOCT4、SOX2andNANOGduringinductionprocess（*meanscomparedwithESCs，P<0.05；**meanscomparedwithESCs，P<0.01）.1.3.3诱导过程各个胚层标志物变化规律随后，我们对诱导过程各阶段细胞的RNA采用RT-PCR方法检测了外胚层（NESTIN、ALCAM、ANPEP）、中胚层（CD19、CD45、TNN2）和内胚层（GATA4、GATA6、SOX7）主要标志物的表达情况。我们发现，更换软骨干细胞扩增培养基后外胚层标志物在诱导末期表达都升高，与诱导前的ESCs相比，差异具有统计学意义；而中胚层和内胚层的标志物，除了H1细胞系的Tnn2在诱导末期增高外，其他基因几乎都没有表达（图4）。随后我们对诱导各个阶段的细胞进行深度测序，并从中筛选出更多各个胚层的标志基因。通过比较诱导后细胞与ESCs各胚层基因的表达差异，我们发现外胚层标志基因在诱导完成后的细胞中普遍高表达，而中、内胚层的基因表达则显著降低（图5）。
本文编号：3209506
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