线粒体NOS1调控结肠癌化疗耐药与Ⅰ型干扰素通路的研究

发布时间：2021-06-25 19:16

　　研究背景和目的一氧化氮（NO）是一种性质活跃的气体信号分子,发挥血管舒张、突触传递及免疫防御等多种生理功能。目前的研究还发现NO与肿瘤关系密切,调控肿瘤的起始、转移、耐药和免疫逃逸等一系列过程。内源性的NO主要由三种一氧化氮合酶（NOS）催化生成。其中NOS1和NOS3为组成型表达,合成低浓度的NO;而NOS2为诱导性型表达,合成高浓度的NO。不同的NOS产生NO的浓度及持续时间不同,决定了其生物学效应的不同。近年来越来越多的研究表明,不同NOS的亚细胞定位也是决定其功能的重要因素之一。目前发现不同的NOS亚型可以定位于细胞膜、溶酶体、高尔基体及细胞核等不同的亚细胞结构中。既往已经有研究显示NO参与了结肠癌发生、发展及转移等一系列过程,但NOS1在结肠癌发生发展中的作用目前尚未见报道。本研究的主要目的是探讨NOS1是否通过其特殊的亚细胞定位参与结肠癌的进展。研究结果1.NOS1定位于结肠癌细胞线粒体:分析TCGA数据库显示NOS1表达量与结直肠腺癌患者的临床分期呈负相关,并且NOS1高表达提示预后较差。为了深入研究NOS1对结肠癌的影响,我们构建了稳定过表达NOS1的结肠癌细胞株。应用... 

【文章来源】：南方医科大学广东省

【文章页数】：104 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图１?ｍｔＮＯＳ对线粒体功能的影响??Ｆｉ．?１?Ｅｆｆｅｃｔｓ?ｏｆ?ｍｔＮＯＳ?ｏｎ?ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ?ｆｌｉｎｃｔｉｏｎ??

筛选阳性细胞。最后用Ｑ－ＰＣＲ和蛋白免疫印迹法分别从ｍＲＮ?Ａ和蛋白水平验证对??照组（ＮＣ）与过表达Ｎ０Ｓ１组（ＯＥ－ＮＯＳ１）结肠癌细胞株中Ｎ０Ｓ１的表达情况。??结果显示０Ｅ－Ｎ０Ｓ１结肠癌细胞Ｎ０Ｓ１的ｍＲＮＡ和蛋白表达均有显著升高（图１－２）。??以上结果说明过表达Ｎ０Ｓ１的结肠癌细胞株构建成功。??Ａ?＞５?１＾］?丁?８?ＮＣ?０Ｅ－Ｎ０Ｓ１??§?ｓｏ－?ｎｏｓｉ?｜?—??ｇａｐｏｈ??｜Ｅ?５〇１?■?：：＾——??？?５?５－ｒ??■??■??〇ｉ?ｍ??ＮＣ?ＯＥ－ＮＯＳ１??图１－２构建过表达ＮＯＳＩ的结肠癌细胞株??（Ａ）?Ｑ－ＰＣＲ检测ＮＯＳ１的ｍＲＮＡ的表达；（Ｃ）?ＷＢ检测ＮＯＳ１蛋白的表达；??Ｆｉｇ．?１－２?Ｃｏｌｏｎ?ｃａｎｃｅｒ?ｃｅｌｌ?ｌｉｎｅｓ?ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ?ＮＯＳＩ?ｗｅｒｅ?ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ??（Ａ）?ＮＯＳＩ?ｍＲＮＡ?ｉｎ?ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｃｅｌｌｓ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｄｃｔｅｄ?ｂｙ?Ｑ－ＰＣＲ；?（Ｂ）?ＮＯＳＩ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｉｎ??ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ?ｃｅｌｌｓ?ｗａｓ?ｄｅｔｅｄｃｔｅｄ?ｂｙ?ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔｔｉｎｇ．??第３节提取细胞线粒体，观察ＮＯＳＩ在线粒体的定位??为了验证ＮＯＳ１是否在定位于线粒体内

异性标记物Ｍｉｔｏｔｒａｋｅｒ－ＲＥＤ标记线粒体，使线粒体带有红色荧光，使用绿色荧光??蛋白（ＧＦＰ）标记Ｎ０Ｓ１蛋白。我们在共聚焦显微镜下清晰地观察到Ｎ０Ｓ１（绿色??荧光）与线粒体（红色荧光）存在共定位关系（重叠后呈现黄色）（图１－４）。此结果进??一步表明Ｎ０Ｓ１在结肠癌细胞线粒体内表达。??■■ＭＭ?，，??Ｉ?ｓｏ．?＾?＾??１Ｗ??ＮＯＳｌ?Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ?Ｍｅｒｇｅ?＾??图１＿４共聚焦显微镜观察线粒体与Ｎ０Ｓ１的共定位关系。??Ｆｉｇ．?１－４?Ｔｈｅ?ｃｏ－ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ?ｂｅｔｗｅｅｎ?ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ?ａｎｄ?ＮＯＳｌ?ｗａｓ?ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ?ｂｙ?ｃｏｎｆｏｃａｌ??ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．??第５节过表达ＮＯＳｌ增加线粒体内一氧化氮含量??ＮＯＳ１是一种钙离子依赖性一氧化氮合酶，而线粒体内的钙离子浓度较高。??因此我们推测，线粒体内ＮＯＳ?１蛋白表达的增加会提高线粒体内一氧化氮的含量，??进而影响线粒体生物学功能。由于一氧化氮是一种不稳定的气体分子，我们通??过检测其下游代谢物亚硝酸／硝酸盐以反映ＮＯ水平。结果显示过表达Ｎ０Ｓ１??（０Ｅ－Ｎ０Ｓ１）明显增加线粒体内亚硝酸／硝酸盐含量（图１－５）。该结果进一步证??明ＮＯＳ?１在线粒体内表达，并增加了线粒体内ＮＯ水平。??３０??


本文编号：3249799