筛选与鉴定骨髓增生异常综合征进展相关表观遗传学驱动分子及其临床意义
发布时间：2021-07-01 18:30
目的骨髓增生异常综合征（MDS）一种高度异质性的髓系肿瘤,约有30%的MDS患者可能进展为急性髓系白血病（AML,亦称sAML）,一旦转变预后极差。截至目前为止,MDS疾病转变的机制尚未完全明确,遗传学和表观遗传学改变在其中扮演重要作用。本研究旨在探究MDS转AML中全基因组DNA甲基化改变,同时筛选和验证驱动疾病进展相关的表观分子,并分析其临床意义。方法应用全基因组简化甲基化测序（RRBS）分析4例对照和4例配对MDS/sAML患者不同阶段甲基化态势。同时应用生物信息等方法筛选具有预后意义和潜在生物学功能的相关基因。应用实时定量甲基化特异性PCR（RQ-MSP）、亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）及MethylTarget靶向测序等方法进一步扩大标本验证和确定候选基因甲基化改变。实时定量PCR（RQ-PCR）及Western Blot（WB）等方法检测候选基因的表达水平。基于临床标本参数等进行临床意义和预后分析。同时通过细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖等实验评价候选基因功能。结果在4例配对MDS/sAML患者中,随着疾病进展处于sAML阶段的全基因组甲基化水平显著高于MDS阶段。MDS阶段与...
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
ID4基因与人不同恶性肿瘤中相关性
筛选与鉴定骨髓增生异常综合征进展相关表观遗传学驱动分子及其临床意义10图1.2miR-335通过靶向多种编码基因参与肿瘤发生发展的多种生物学过程及信号通路。[128]1.6DLX5基因1.6.1概述人类DLX同源盒基因主要编码表达与胚胎发育相关的转录因子，其结构与Dll（Distal-less，果蝇无远端基因）类似，在发育中的前脑和颅面结构中表达[135]。人类有六个DLX基因，由三个生物基因簇DLX1/DLX2、DLX3/DLX4和DLX5/DLX6[135]。其中，DLX5位于染色体7q21.3区域。在正常生理过程中，DLX5和DLX6共同作用，对于正常颅面，轴向和附肢骨骼发育都是必需的[136]。本人在硕士期间已经对DLX4进行初步研究，发现髓系肿瘤中DLX4存在高甲基化现象，并且跟MDS和AML患者预后相关，与慢性粒细胞白血病的疾病进展相关[64,137-139]。1.6.2DLX5与肿瘤截止目前为止，针对DLX5在肿瘤中的作用尚未明确。既往几篇报道揭示转录因子DLX5存在致癌活性。DLX5基因在卵巢癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌中的过表达刺激细胞增殖[140,141]。在小鼠和人类癌细胞中使用siRNA方法敲减DLX5表达导致细胞增殖停滞[140,141]。此外，DLX5对原癌基因c-myc的表达有直接影响作用[140]。针对血液淋系肿瘤，目前只有一篇报道发现：DLX5通过直接激活Notch
筛选与鉴定骨髓增生异常综合征进展相关表观遗传学驱动分子及其临床意义24图3.14例配对MDS/sAML患者中MDS和sAML阶段全基因组甲基化程度。检验方法使用配对T检验。3.3.2对照及配对MDS/sAML患者差异甲基化分析我们以酶切片段作为分析的基本单元[149-151]，以配对或者独立样本T检验<0.05以及差异性甲基化>25%作为差异性甲基化的条件进行初步分析和筛选，定义为差异性甲基化片段（differentiallymethylatedfragments，DMFs）。拟探索参与MDS发病相关的甲基化改变，我们通过对比对照组与患者MDS阶段，一共筛选出1090个DMFs，其中包括441个高甲基化片段及649个低甲基化片段，其结果以热图展示（图3.2）；拟探索参与MDS进展相关的甲基化改变，我们通过对比配对患者MDS阶段与sAML阶段，一共筛选出103个DMFs，其中包括96个高甲基化片段及7个低甲基化片段，其结果以热图展示（图3.2）。此外，我们进一步分析了差异性甲基化位点在染色体、CpG岛以及基因结构上的定位（图3.3）。此外，我们进一步以CpG岛（CGI）、启动子（Promoter）以及基因内（Genebody）作为分析的基本单元进行差异性分析。针对CGI，通过对比配对患者MDS阶段与对照，MDS发病相关的候选甲基化改变一共筛选出74个差异性甲基化CpG岛，其中包括37个高甲基化CpG岛及37个低甲基化CpG岛；通过对比配对患者MDS阶段与sAML阶段，MDS进展相关的候选甲基化改变一共筛选出32个差异性甲基化CpG岛，均为高甲基化CpG岛（图3.2）。针对Promoter，通过对比配对患者MDS阶段与对照，MDS发病相关的甲基化改变一共筛选出54个差异性甲基化Promoter，其中包括22个高甲基化Promoter及32个低甲基化Promoter；通过对比配对患者MDS阶段与sAML阶段，MDS进展相关的甲基化改变一共筛选出9个差异性甲基化Promoter，?
本文编号：3259648
【文章来源】：江苏大学江苏省
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
ID4基因与人不同恶性肿瘤中相关性
筛选与鉴定骨髓增生异常综合征进展相关表观遗传学驱动分子及其临床意义10图1.2miR-335通过靶向多种编码基因参与肿瘤发生发展的多种生物学过程及信号通路。[128]1.6DLX5基因1.6.1概述人类DLX同源盒基因主要编码表达与胚胎发育相关的转录因子，其结构与Dll（Distal-less，果蝇无远端基因）类似，在发育中的前脑和颅面结构中表达[135]。人类有六个DLX基因，由三个生物基因簇DLX1/DLX2、DLX3/DLX4和DLX5/DLX6[135]。其中，DLX5位于染色体7q21.3区域。在正常生理过程中，DLX5和DLX6共同作用，对于正常颅面，轴向和附肢骨骼发育都是必需的[136]。本人在硕士期间已经对DLX4进行初步研究，发现髓系肿瘤中DLX4存在高甲基化现象，并且跟MDS和AML患者预后相关，与慢性粒细胞白血病的疾病进展相关[64,137-139]。1.6.2DLX5与肿瘤截止目前为止，针对DLX5在肿瘤中的作用尚未明确。既往几篇报道揭示转录因子DLX5存在致癌活性。DLX5基因在卵巢癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌中的过表达刺激细胞增殖[140,141]。在小鼠和人类癌细胞中使用siRNA方法敲减DLX5表达导致细胞增殖停滞[140,141]。此外，DLX5对原癌基因c-myc的表达有直接影响作用[140]。针对血液淋系肿瘤，目前只有一篇报道发现：DLX5通过直接激活Notch
筛选与鉴定骨髓增生异常综合征进展相关表观遗传学驱动分子及其临床意义24图3.14例配对MDS/sAML患者中MDS和sAML阶段全基因组甲基化程度。检验方法使用配对T检验。3.3.2对照及配对MDS/sAML患者差异甲基化分析我们以酶切片段作为分析的基本单元[149-151]，以配对或者独立样本T检验<0.05以及差异性甲基化>25%作为差异性甲基化的条件进行初步分析和筛选，定义为差异性甲基化片段（differentiallymethylatedfragments，DMFs）。拟探索参与MDS发病相关的甲基化改变，我们通过对比对照组与患者MDS阶段，一共筛选出1090个DMFs，其中包括441个高甲基化片段及649个低甲基化片段，其结果以热图展示（图3.2）；拟探索参与MDS进展相关的甲基化改变，我们通过对比配对患者MDS阶段与sAML阶段，一共筛选出103个DMFs，其中包括96个高甲基化片段及7个低甲基化片段，其结果以热图展示（图3.2）。此外，我们进一步分析了差异性甲基化位点在染色体、CpG岛以及基因结构上的定位（图3.3）。此外，我们进一步以CpG岛（CGI）、启动子（Promoter）以及基因内（Genebody）作为分析的基本单元进行差异性分析。针对CGI，通过对比配对患者MDS阶段与对照，MDS发病相关的候选甲基化改变一共筛选出74个差异性甲基化CpG岛，其中包括37个高甲基化CpG岛及37个低甲基化CpG岛；通过对比配对患者MDS阶段与sAML阶段，MDS进展相关的候选甲基化改变一共筛选出32个差异性甲基化CpG岛，均为高甲基化CpG岛（图3.2）。针对Promoter，通过对比配对患者MDS阶段与对照，MDS发病相关的甲基化改变一共筛选出54个差异性甲基化Promoter，其中包括22个高甲基化Promoter及32个低甲基化Promoter；通过对比配对患者MDS阶段与sAML阶段，MDS进展相关的甲基化改变一共筛选出9个差异性甲基化Promoter，?
本文编号：3259648
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