熊果酸抑制NF-κB活化防治大鼠静脉再狭窄的实验研究

发布时间：2017-04-25 20:16

  本文关键词：熊果酸抑制NF-κB活化防治大鼠静脉再狭窄的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景与目的冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass graft, CABG)是治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病的主要外科方法,也是冠状动脉再血管化最重要的治疗手段之一。在临床上,移植血管有动脉和静脉两种,常用的有桥血管来源有乳内动脉、桡动脉和大隐静脉。乳内动脉是最常用的动脉桥血管,但是其长度有限。桡动脉在应用的过程中会出现患者无法接受的并发症。这些都使得动脉桥的应用受到了很大的限制。大隐静脉由于位置表浅,口径较大,取材方便,两侧下肢又有足够的长度连接主动脉与远端冠状动脉,多年以来使其在冠状动脉旁路移植术中得到了广泛的应用。乳内动脉是冠状动脉旁路移植术中通畅率最高的血管,随访资料显示,冠状动脉旁路移植术中乳内动脉吻合前降支,1年通畅率达95.7%,10年通畅率在90%以上,明显优于大隐静脉。研究表明大隐静脉1年内可能发生静脉吻合口血栓形成、近端狭窄等并发症,1年、5年的通畅率分别为93%、74%。10年通畅率仅为50%-60%,长期效果明显不如乳内动脉。静脉桥的再狭窄大大降低了手术的远期效果,对于再狭窄的发生机制仍有许多不明之处,目前认为再狭窄可能与大隐静脉游离过程中的损伤,术后血流动力学的改变以及炎症因子释放等一系列变化,术后新生内膜增生、血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖、迁移所造成的血管重塑共同作用的结果。术后较高的再狭窄发生率已经成为影响自体静脉在冠状动脉旁路移植术后中远期疗效最主要的限制因素。熊果酸(ursolic acid, UA)又名乌苏酸、乌索酸,是广泛存在于自然界中的α-香树脂醇型五环三萜类化合物,分子式为C30H48O3,通常以游离或与糖结合成苷的形式存在,分布于自然界中约7个科46个属62种植物中。熊果酸是脂溶性物质,可穿透细胞膜起效。实验证明熊果酸具有广泛的生物学活性,包括抗细胞突变、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用。目前,熊果酸抗肿瘤机制已成为当今研究的热点。同时,熊果酸保护心脑血管等药理作用已经被广泛证实。跟心血管相关的生物学活性包括舒张血管、上调一氧化氮合酶、抑制脂质过氧化。在胰岛素抵抗的鼠高血压模型中,显示出具有抗高血压、减慢心率、抗高血脂和抗高血糖的作用。目前对熊果酸的药理作用机制研究较多,对心血管的作用主要有抗动脉粥样硬化,抑制新生血管,抗氧化及诱导细胞凋亡等。研究显示熊果酸能通过抑制NF-κB的活化。NF-κB是介导炎症及免疫反应的中心物质,同时也是细胞凋亡信号传导通路中重要的转录调节因子,几乎存在于所有的细胞中,其靶基因包括免疫相关受体、细胞因子(如IL-1、IL-2、IL-6、 IL-12和TNF-α、LTα、 LTβ、GM-CSF)、炎症因子(MIP-1α、MCP-1)、粘附分子(ICAM、VCAM、E-selectin)急性期蛋白(如SSA)等。NF-κB主要通过介导炎症反应,NF-κB可以促进各种炎症因子和细胞因子的基因转录,这些炎症因子和细胞因子又可以反过来激活NF-κB,这种正反馈的效应进一步放大了炎症反应。对血管平滑肌细胞增生、凋亡的影响而在再狭窄的过程中起着重要的作用。抑制NF-κB介导的炎症反应可为静脉桥再狭窄防治提供新的治疗靶点。静脉移植动物模型是研究冠状动脉旁路移植术后再狭窄的主要方法,既可以研究静脉桥的病理变化、发病机制,又可以用于检验干预措施是否有效。目前研究移植静脉桥再狭窄的动物模型有猪、犬等大动物,也有大鼠、兔子等小动物。大动物操作相对简单,但所需费用较高。小动物价格便宜,易于饲养及管理。但由于其血管直径小,吻合操作困难,需要具备血管吻合相关技能的人员参与操作。实验性自体静脉移植模型多种多样,血管桥主要为颈外静脉和大隐静脉,移植部位多在颈动脉、腹主动脉或股动脉。有研究表明,影响移植物早期再狭窄的主要原因是吻合技术和血栓形成。在静脉桥再狭窄模型的建立过程中血管吻合方法主要有连续缝合、间断缝合和Cuff套管法。目前国内外研究再狭窄的动物模型中关于大鼠血管移植模型的报道相对较少,主要是采用显微外科缝合方法。因其需要精巧的显微外科技术和很扎实的外科基本功,手术中操作空间小,常常因血管暴露不清造成误缝或管壁撕裂,而导致吻合口出血和狭窄。因此改进静脉移植模型,提高近期通畅率,减少手术操作本身对血管的损伤对延长大鼠术后存活时间十分必要。本实验总共分为三部分,实验目的是为了研究熊果酸对大鼠静脉再狭窄的影响及机制,同时研究Cuff套管技术在大鼠静脉再狭窄模型中的应用。(1)两种自体静脉移植再狭窄大鼠模型的对比研究：利用大鼠颈外静脉作为桥血管,分别将颈外静脉移植至颈总动脉和腹主动脉。建立两种自体静脉再狭窄大鼠模型。将两种模型建立过程和静脉桥内膜和中膜的狭窄情况进行对比研究。研究两种动物模型在模型建立过程及建立后静脉桥狭窄情况的异同。(2)熊果酸在大鼠自体静脉移植再狭窄模型中抑制血管桥增生狭窄的实验研究：将大鼠的颈外静脉用Cuff吻合法移植至颈总动脉,建立大鼠静脉桥再狭窄的动物模型。设立对照组,实验组大鼠给予两种不同剂量的熊果酸,研究不同剂量的熊果酸对静脉桥不同时期内膜、中膜增生的抑制作用,细胞增生及凋亡的影响。(3)熊果酸在大鼠自体静脉移植再狭窄模型中抑制血管炎症的实验研究：将大鼠的颈外静脉用Cuff吻合法移植至颈总动脉,建立大鼠静脉桥再狭窄的动物模型。予以熊果酸抑制NF-κB的活化,检测静脉桥炎症反应过程中MCP-1、 IL-1α、IL-6及TNF-α的变化,研究熊果酸抑制静脉再狭窄作用机制。研究方法(1)将30只大鼠随机分成A、B共2组,每组15只。术前对实验大鼠禁食8小时,禁水4小时。均以右侧颈外静脉作为自体移植静脉,以Cuff套管法为吻合方法,A组将右侧颈外静脉移植至右侧颈总动脉,B组移植至腹主动脉,分别建成两种自体静脉再狭窄的动物模型。术后满第1周、第2周和第4周分三次取材,每次随机选取5只大鼠。麻醉后从原切口找到静脉桥,观察桥静脉通畅后切取静脉。取下后用生理盐水冲洗,4%多聚甲醛冲洗固定,常规脱水,石蜡包埋,切片厚度为4μm。随机选取5个不同位置的切片做HE染色,计算内膜、中膜厚度。(2)将45只大鼠随机分成A、B、C共3组,每组15只。术前对实验大鼠禁食8小时,禁水4小时。均以右侧颈外静脉作为自体移植静脉,以Cuff套管法为吻合方法,将右侧颈外静脉移植至右侧颈总动脉。A组为对照组,在静脉移植至颈总动脉后不予药物干预,B组术后第一天开始予以15mg/(kg.d)熊果酸灌胃,C组术后第一天开始予以30mg/(kg.d)熊果酸灌胃。在术后满第1周、第2周和第4周分三次取出静脉桥标本,每次每组随机选取5只大鼠,麻醉后从原切口找到静脉桥,观察桥静脉通畅后切取静脉。切片厚度为4μm。对静脉桥切片行HE染色、Masson染色、PCNA染色、TUNEL检测。研究不同剂量的熊果酸对静脉桥不同时期内膜、中膜增生的抑制作用,细胞增生及凋亡的影响。(3)将45只大鼠随机分成A、B、C共3组,每组各15只。A组为对照组,不作任何处理。B组为模型组,将颈外静脉移植至颈总动脉后不予药物干预。C组为熊果酸组,将右侧颈外静脉移植至颈总动脉后术后当天开始予以30mg/(kg.d)熊果酸灌胃。B、C组大鼠术前禁食8小时,禁水4小时。均以右侧颈外静脉作为自体移植静脉,以Cuff套管法为吻合方法,将右侧颈外静脉移植至右侧颈总动脉。B、C组分别在术后第48h处死大鼠切取移植静脉,A组取右侧颈外静脉,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞因子MCP-1、 IL-1α、IL-6及TNF-α。对比研究3组静脉细胞因子的含量。研究结果(1)两组大鼠共30只全部成活,术后活动、饮食均正常,切口愈合良好。取材时共30条桥静脉均通畅,搏动良好。两组大鼠手术过程顺利。B组手术时间、吻合时间均较A组长,两组相比P0.05,且差异有统计学意义。两组大鼠随着术后时间的延长,内膜和中膜的厚度也逐渐增厚。B组大鼠在1W、2W和4W不同的时间点,内膜和中膜的厚度分别与A组相比较,P0.05。差异均无统计学意义。(2)随着时间的延长,所有静脉桥的内膜和中膜的厚度均有逐渐增厚的趋势。两种剂量的熊果酸对内膜和中膜的增厚均有不同程度的抑制作用。相对应的时间点不管是内膜还是中膜的厚度,B组与A组相比P0.05,C组与A组相比P0.05,C组与B组相比P0.05。本实验表明,每天给予的熊果酸剂量不同,对血管增生的抑制效果也不同。30mg/(kg.d)的熊果酸比15mg/(kg.d)具有更好的抑制内膜和中膜增生的效果。3组静脉桥在不同的时间所取的标本内膜和中膜均能见到PCNA阳性细胞,两种不同浓度的熊果酸均具有抑制细胞增殖的作用。相对应时间点的细胞增殖指数,B组与A组相比P0.05,C组与A组相比P0.05,C组与B组相比P0.05。本研究表明,30mg/(kg.d)的熊果酸较15mg/(kg.d)具有更好的抑制内膜和中膜细胞增殖的效果。3组静脉桥在不同的时间所取的标本内膜和中膜均能见到凋亡细胞。相对应时间点的内膜细胞凋亡指数,B组与A组相比P0.05,C组与A组相比P0.05,C组与B组相比P0.05。本研究表明,30mg/(kg.d)的熊果酸比15mg/(kg.d)具有更好的诱导内膜细胞凋亡的效果。两种不同浓度的熊果酸均具有诱导内膜细胞增殖的作用。相对应的时间点中膜细胞凋亡指数B组与A组相比P0.05,C组与A组相比P0.05,C组与B组相比P0.05。本研究表明,30mg/(kg.d)和15mg/(kg.d)的熊果酸并没有诱导中膜细胞凋亡的作用。(3)B组和C组细胞因子MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α均较A组显著增高,且差异具有统计学意义。在术后应用熊果酸组治疗的C组较未予熊果酸的B组细胞因子MCP-1、 IL-1α、IL-6及TNF-显著降低,且差异具有统计学意义。结论(1)两种模型均为目前动物实验中为反映冠状动脉旁路移植术后移植静脉再狭窄病理过程所用的理想模型。Cuff套管法建立大鼠颈外静脉移植到颈总动脉模型,操作简单,成功率高,死亡率低,短期内无免疫排斥反应,有利于开展大规模的动物实验。此模型是研究移植静脉内膜增生和狭窄的发病机制、病理变化及探讨其防治措施理想的动物模型。(2)熊果酸能够抑制静脉移植后的再狭窄。剂量为30mg/(kg.d)的熊果酸比15mg/(kg.d)具有更好的抑制内膜和中膜增殖的效果。剂量为30mg/(kg.d)的熊果酸比15mg/(kg.d)具有更好的诱导内膜细胞凋亡的效果。但30mg/(kg.d)和15mg/(kg.d)的熊果酸并没有诱导中膜细胞凋亡的作用。(3)在移植静脉再狭窄的模型中,各种因素导致血管的炎症,进而引起血管壁重塑是静脉再狭窄最重要的原因。熊果酸能够抑制静脉移植后血管壁的炎症,有效防治静脉的再狭窄。熊果酸的作用机制是通过抑制NF-κB的活化,抑制了MCP-1、IL-1α、IL-6及TNF-α基因表达。术后早期应用抑制血管炎症的药物可以有效防治静脉的再狭窄。
【关键词】：熊果酸 静脉桥 内膜增生 再狭窄 疾病模型
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.6
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 两种自体静脉移植再狭窄大鼠模型的对比研究18-39
• 1.1 前言18-19
• 1.2 材料与方法19-23
• 1.3 结果23-29
• 1.4 讨论29-34
• 1.5 结论34
• 1.6 参考文献34-39
• 第二章 熊果酸在大鼠自体静脉移植再狭窄模型中抑制血管桥再狭窄的实验研究39-72
• 2.1 前言39-40
• 2.2 材料与方法40-49
• 2.3 结果49-62
• 2.4 讨论62-67
• 2.5 结论67
• 2.6 参考文献67-72
• 第三章 熊果酸在大鼠自体静脉移植再狭窄模型中抑制血管炎症的实验研究72-88
• 3.1 前言72-74
• 3.2 材料与方法74-77
• 3.3 结果77-78
• 3.4 讨论78-84
• 3.5 结论84
• 3.6 参考文献84-88
• 综述一 熊果酸药理作用的研究进展88-100
• 参考文献94-100
• 综述二 冠状动脉旁路移植术后静脉桥狭窄病因及基因治疗的研究100-113
• 参考文献106-113
• 英文缩略词一览表113-115
• 在读期间发表论文115-116
• 致谢116-118
• 统计学证明118

  本文关键词：熊果酸抑制NF-κB活化防治大鼠静脉再狭窄的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：327018