HCN通道在DO大鼠膀胱ICC细胞上的表达和电生理特性研究

发布时间：2017-04-26 16:13

本文关键词：HCN通道在DO大鼠膀胱ICC细胞上的表达和电生理特性研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景和目的:膀胱过度活动症(OAB)是由逼尿肌过度活动(DO)导致的泌尿科常见疾病,临床表现为尿频、尿急和紧迫性的尿失禁,如不及时治疗,会导致肾盂,输尿管功能受损并会引起肾积水、最终导致肾功能损害,给患者生活带来很多不便和沉重的经济负担。OAB的发病机制目前尚未阐明,膀胱逼尿肌兴奋性异常是导致的DO的直接原因,研究发现神经疾病、膀胱出口梗阻和泌尿系统感染等均可引起DO。膀胱逼尿肌兴奋性受自主神经和体神经的双重支配,因此其兴奋调控机制较为复杂。目前,神经源性和肌源性两大学说为最主要的膀胱调控理论。但是,单一的神经源性或者肌源性学说都不能完全解释膀胱兴奋调控机制,例如:神经源性学说不能解释膀胱离体逼尿肌条自发性收缩现象,肌源性学说不能解释膀胱收缩“全/无”的现象,因此,找到这两大学说关于膀胱兴奋调控的功能通路,将有助于深入阐述膀胱的兴奋调控和OAB发病机制。1996年,Smet等人首先发现在豚鼠和人的膀胱中存在和胃肠道ICC细胞类似的膀胱ICC细胞,其分布于膀胱粘膜下层和平滑肌肌束间。组织结构上,膀胱ICC细胞与神经和逼尿肌细胞间存在紧密的联系。同时证实粘膜下ICC细胞与胆碱神经丛紧密相连,并且在ICC细胞上面表达M2、M3胆碱能受体;电镜显示ICC细胞与膀胱逼尿肌细胞之间存在紧密的缝隙连接;这些都说明膀胱ICC细胞在膀胱兴奋调控中的枢纽作用。其发现为我们找到神经源性/肌源性这两大学说关于膀胱兴奋调控机制的共同通路提供了可能,研究膀胱ICC细胞的兴奋传导和调控机理,会有助于我们深入了解膀胱的兴奋调控及OAB发病机理,为OAB的治疗提供新的理论基础和靶点。HCN(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide cation channel,HCN)通道是超极化激活环核苷酸门控的阳离子通道,其由6个跨膜片段(S1-S6)组成,位于S5和S6间的一段氨基酸序列部分形成K+离子选择性通道所特有的GYG标志序列。HCN通道所介导的Ih电流被认为是起搏细胞的重要特征,在包括心脏和大脑起搏活性的生理功能上发挥重要的作用。研究发现膀胱ICC细胞表达HCN1-4通道亚型,可产生hcn通道内向超极化电流ih。hcn通道阻滞剂zd7288可降低膀胱icc细胞内t型钙通道电流,并可显著降低膀胱逼尿肌收缩频率和幅度。这说明hcn通道可调控钙离子轴影响膀胱icc细胞兴奋。因此hcn通道源性的icc细胞兴奋调节在膀胱兴奋调控中发挥重要作用。在许多疾病状态下,hcn通道的活化和生理特性会发生变化。研究发现衰竭心脏的心室肌细胞中hcn通道活化增强。因此我们猜想do可能与膀胱icc细胞hcn通道的变化有关。研究do膀胱icc细胞中hcn通道的表达和电生理变化有利于阐明do的发病机制,并为治疗do提供新的靶点。而do的发病原因以pboo性疾病最为多见,其中以bph最为多见。大量的研究表明,膀胱出口梗阻后膀胱icc细胞数量和生理功能的改变在pboo所致do的发生发展中发挥重要作用。综上所述,基于hcn源性的icc细胞兴奋在膀胱兴奋中的调控作用,本研究拟用pboo的方法来构建do大鼠模型,并用假手术组大鼠做正常对照。通过分子生物学和免疫学方法检测hcn通道各亚型在膀胱icc细胞中的表达变化,用电生理学方法检测hcn通道的电生理变化,并探讨hcn通道对正常和do大鼠膀胱的收缩功能影响。方法:第一部分:do大鼠模型的建立和鉴定通过pboo的方法来建立do大鼠模型,行下腹部正中切口,对大鼠膀胱出口处进行结扎模拟膀胱出口部分梗阻,术后缝合下腹部。假手术组大鼠只进行切开并缝合,不做下尿道接扎。手术完成后8周行膀胱充盈性测压实验,观察大鼠膀胱的排尿收缩是否正常。对于手术组大鼠,如果膀胱充盈性测压实验显示非正常的膀胱排尿收缩记为do模型大鼠;假手术组大鼠则记为正常对照组。第二部分:hcn通道在do大鼠膀胱icc细胞中的表达变化1.取正常对照组和do模型组大鼠膀胱,用rt-pcr的方法检测hcn1-4通道亚型mrna在do膀胱icc细胞上的表达变化;2.取正常对照组和do模型组大鼠膀胱,用wb的方法检测hcn1-4通道亚型蛋白在do膀胱icc细胞上的表达变化;3.取正常对照组和do模型组大鼠膀胱,用免疫荧光双标染色的方法检测hcn1-4通道亚型在do膀胱icc细胞上的表达变化。第三部分:hcn通道在do大鼠膀胱icc细胞中的电生理变化及对膀胱收缩功能影响1.分离得到正常对照组和do模型组大鼠膀胱icc细胞,用膜片钳的方法检测hcn通道电流ih的密度和激活电压变化情况;2.分离得到正常对照组和do模型组大鼠膀胱icc细胞,用活细胞工作站的方法检测hcn通道特异性阻滞剂zd7288对两组icc细胞内钙离子浓度的影响;3.取正常对照组和do模型组大鼠膀胱进行肌条实验,观察hcn通道特异性阻滞剂zd7288对两组膀胱逼尿肌收缩功能的影响。结果:第一部分:do模型大鼠的建立和鉴定膀胱充盈性测压实验显示do组大鼠膀胱的排尿反射不是呈现充盈-排尿-充盈的膀胱排尿反射,而是出现非自主的过度活动的膀胱排尿反射。证明pboo手术成功构建do大鼠模型。第二部分:hcn通道在do模型大鼠膀胱icc细胞中的表达变化1.rt-pcr的结果显示hcn1-4通道亚型mrna在do大鼠膀胱icc细胞上的表达相对于对照组有明显增加;2.wb的结果显示hcn1-4通道亚型蛋白在do大鼠膀胱icc细胞上的表达相对于对照组有明显增加;3.免疫荧光双标的结果显示hcn1-4通道亚型蛋白在do大鼠膀胱icc细胞上的表达相对于对照组有明显增加。第三部分:hcn通道在do模型大鼠膀胱icc细胞中的电生理变化及对膀胱收缩功能影响1.膜片钳的结果显示do大鼠膀胱icc细胞上ih电流密度相比于对照组icc细胞明显增加,并且ih电流的的最大半激活电压v1/2也明显降低;2.活细胞工作站的结果显示10μmol/l的zd7288可以明显抑制对照组icc细胞内钙离子浓度,而同样10μmol/l的zd7288却不能抑制do组icc细胞内钙离子浓度。当zd7288的浓度上升到50μmol/l时,对照和正常组icc细胞内的钙离子浓度都会受到明显抑制;3.膀胱逼尿肌条实验的结果显示10μmol/l的zd7288可以明显抑制对照组逼尿肌条的收缩幅度,而同样10μmol/l的zd7288却不能抑制do组膀胱逼尿肌条的收缩幅度。当zd7288的浓度上升到50μmol/l时,do模型组和正常对照组逼尿肌条的收缩幅度都会受到明显抑制。结论:本课题探索hcn通道在do模型大鼠膀胱icc细胞上的表达和电生理性质变化:一、在PBOO所致DO模型大鼠膀胱ICC细胞中HCN通道mRNA和蛋白的表达量较正常对照组有明显升高。二、DO模型大鼠膀胱ICC细胞中Ih电流密度升高,并且随着HCN通道的表达量升高会造成膀胱ICC细胞内的钙离子信号和膀胱收缩功能的增强。结果提示HCN通道可能参与DO的发病,为临床DO的诊治提供理论依据和新的治疗靶点。
【关键词】：膀胱 逼尿肌过度活动 ICC细胞 HCN通道 尿动力学
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R694.5
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