基于DYRK1A蛋白质结构的小分子抑制剂的发现以及活性评价

发布时间：2021-07-21 18:54

　　双底物特异性酪氨酸磷酸化调节激酶 1A（dual-specificity tyro-sine-（Y）-phosphorylation-regulated kinase 1A,DYRK1A）在胰腺癌以及糖尿病中高表达并异常激活,与肿瘤的发生发展以及胰岛β细胞的增殖密切相关。因此,靶向DYRK1A抑制剂的研发成为治疗胰腺癌和糖尿病的一个新的研究方向。首先通过基因工程技术对重组人源性DYRK1A蛋白进行表达纯化,获得了大量且高纯度的重组人源性DYRK1A蛋白;利用重组DNA技术将DYRK1A目的基因构建到新的表达载体pNIC28-Bsa4上,并实现了 DYRK1A基因的稳定存在和高效克隆。利用课题组从甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）和瘤毛獐牙菜（Swertia pseudochinensis Hara）植物中提取分离得到的天然产物小分子化合物,通过体外激酶实验筛选得到了DYRK1A抑制剂,其中异戊烯基取代的化合物甘草香豆酮（licocoumarone,LC）和根据去甲基雏菊叶龙胆酮（demethylbellidifolin,DMB）结构改造通过化学合成得到的化合... 

【文章来源】：沈阳药科大学辽宁省

【文章页数】：129 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语简表
第一章 绪论
    一、DYRK1A蛋白激酶的三维立体结构
        1.1 结构组成
        1.2 DYRK1A的分布与功能
    二、DYRK1A生理与病理作用
        2.1 DYRK1A在神经病变中的作用研究
        2.2 DYRK1A在肿瘤形成中的作用研究
        2.3 DYRK1A在糖尿病中的作用研究
    三、DYRK1A抑制剂的发现
    四、计算机辅助药物设计
        4.1 基于配体的药物设计
        4.2 基于受体的药物设计
    五、立题依据
第二章 DYRK1A蛋白的表达与纯化
    一、实验材料与仪器
        1.1 宿主菌和重组质粒载体
        1.2 实验仪器
        1.3 生化试剂
            1.3.1 工具酶
            1.3.2 试剂盒
            1.3.3 化学试剂
        1.4 表达用载体质粒
        1.5 引物
        1.6 常用溶液的配制
            1.6.1 蛋白表达所需溶液配制
            1.6.2 SDS-PAGE (Tris-glycine系统)
        1.7 蛋白浓度测定
        1.8 目的基因
    二、实验方法
        2.1 目的基因PCR及克隆
        2.2 重组质粒与表达载体的连接
        2.3 目的蛋白表达鉴定
            2.3.1 小量培养鉴定重组蛋白表达水平
            2.3.2 蛋白大量表达
        2.4 所需工具酶TEV蛋白酶的表达和纯化
    三、实验结果
        3.1 以pNIC28-Bsa4为载体的DYRK1A蛋白的表达与纯化
            3.1.1 基因克隆以及重组质粒的构建
            3.1.2 DYRK1A蛋白表达小量检测结果
            3.1.3 DYRK1A蛋白大量纯化-亲和层析纯化结果
            3.1.4 DYRK1A蛋白大量纯化-离子交换层析结果
            3.1.5 TEV蛋白酶表达纯化结果
            3.1.6 DYRK1A蛋白大量纯-TEV酶酶切后凝胶过滤柱层析结果
        3.2 DYRK1A-pET28a蛋白表达纯化检测结果
            3.2.1 DYRK1A-pET28a蛋白表达小量检测结果
            3.2.2 DYRK1A蛋白大量纯化的结果
    四、讨论
    五、小结
第三章 基于DYRK1A结构的小分子化合物的活性评价及结构优化
    第一节 甘草小分子天然产物抗肿瘤作用研究
        一、实验材料与仪器
            1.1 实验材料
            1.2 实验仪器
            1.3 植物材料
        二、实验方法
            2.1 体外DYRK1A激酶活性实验
            2.2 分子对接
            2.3 微量热泳动实验(MST)
            2.4 DARTS靶点验证实验
            2.5 细胞培养
            2.6 细胞活性检测
            2.7 Bxpc-3胰腺癌细胞增殖实验
                2.7.1 Edu检测细胞增殖实验
                2.7.2 细胞划痕实验
                2.7.3 平板克隆实验
            2.8 Bxpc-3胰腺癌细胞凋亡检测
                2.8.1 Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡
                2.8.2 Heochst 33258荧光染色检测细胞凋亡
            2.9 免疫蛋白印迹
            2.10 统计学处理
        三、实验结果
            3.1 DYRK1A酶抑制活性的测定结果
            3.2 分子对接预测LC与DYRK1A的结合方式
            3.3 LC与DYRK1A结合能力的测定结果
            3.4 DARTS靶点验证结果
            3.5 LC抑制过表达DYRK1A的Bxpc-3胰腺癌细胞系的生长
            3.6 LC抑制Bxpc-3胰腺癌细胞的增殖
                3.6.1 Edu检测细胞增殖的实验结果
                3.6.2 细胞划痕实验结果
                3.6.3 平板克隆实验结果
            3.7 Bxpc-3胰腺癌细胞凋亡检测结果
                3.7.1 流式细胞仪检测Bxpc-3胰腺癌细胞凋亡结果
                3.7.2 Bxpc-3胰腺癌细胞细胞细胞凋亡形态观察
            3.8 LC抑制DYRK1A促进c-MET的降解
        四、讨论
        五、小结
    第二节 1,3,5,8-四羟基吖啶酮类化合物的设计、合成及活性评价
        一、实验试剂与仪器
            1.1 实验试剂
            1.2 实验仪器
            1.3 显色方法
        二、吖啶酮类化合物的化学结构与合成路线
            2.1 1,3,5,8-四羟基吖啶酮的合成
                2.1.1 2,5-二羟基苯甲酸甲酯的合成
                2.1.2 氧化银氧化2,5-二羟基苯甲酸甲酯
                2.1.3 合环反应
                2.1.4 脱甲基化反应
            2.2 体外DYRK1A激酶活性实验
            2.3 分子对接
        三、实验结果
            3.1 Swertia pseudochinensis Hara獐牙菜属小分子化合物构效关系探讨
            3.2 波谱数据
            3.3 DYRK1A酶抑制活性的测定结果
            3.4 分子对接预测化合物与DYRK1A的结合方式
                3.4.1 预测DMB与DYRK1A结合方式
                3.4.2 预测2-2与DYRK1A结合方式
                3.4.3 对接打分
                3.4.4 对接复合物的氢键作用
        四、讨论
        五、小结
全文结论
参考文献
附录
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致谢
附件



本文编号：3295586