VEGF-C基因促进胃癌淋巴管形成及相关miRNAs鉴定实验研究

发布时间：2017-04-27 17:11

  本文关键词：VEGF-C基因促进胃癌淋巴管形成及相关miRNAs鉴定实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景与目的：胃癌是常见恶性肿瘤之一,尽管胃癌的发病率近几十年来有所下降,但在世界范围内,尤其是亚洲东部地区,每年的新发病例量却不断在增加。目前全世界所有因恶性肿瘤死亡病例中,因胃癌导致的死亡已高达10%左右,在所有因肿瘤导致的死亡原因中仅次于肺癌排第二位。淋巴转移是胃癌远隔转移扩散的主要途径,也是促使胃癌患者死亡的重要因素。然而由于淋巴管内皮细胞长期以来没有很好的特异性标志物,对其研究相对是个盲区,因此,破解淋巴道转移之谜,成为了攻克胃癌的瓶颈问题,目前淋巴管生成(Lymphangiogenesis)已成为肿瘤转移研究领域的热点之一。已有的相关研究报道胃癌组织中VEGF-C的表达增加,提示可能VEGF-C在胃癌淋巴转移中产生作用,尽管已有大量关于VEGF-C基因的研究,但在胃癌的淋巴道转移机制研究当中,单单凭VEGF-C分泌增多及其直接促进淋巴管生成效应不足以解释,这就促使我们寻找其调控机制。本研究寄希望通过慢病毒转染技术,构建高表达VEGF-C基因人胃癌细胞株,在体外观察人胃癌细胞中VEGF-C基因高表达对淋巴内皮细胞管形成能力的影响,并借助于人胃癌诱导过的淋巴管内皮细胞与未处理的淋巴管内皮细胞作为研究对象,应用高通量的miRNAs芯片技术比较两者miRNAs表达谱的差异水平,寻找人胃癌淋巴管生成相关的miRNAs,深入探索人胃癌淋巴管生成的调控机制。方法：通过荧光实时定量RT-PCR及Western Blot方法检测VEGF-C在不同类型的人胃癌细胞株(BGC-823、NCI-N87、SGC-7901、MKN-45、MKN-28、GES-1) 中mRNA及蛋白的表达水平,并确定VEGF-C基因或蛋白水平表达较低的细胞株(MKN-45)作为目的细胞。通过构建人VEGF-C基因过表达慢病毒载体并感染目的细胞,建立胃癌促淋巴管生成的体外模型,观察VEGF-C基因高表达对淋巴管内皮细胞管形成能力的影响实验对象分为三组,其中以VEGF-C过表达慢病毒载体感染细胞为实验组、空白病毒转染为对照组和未转染胃癌细胞为空白组。应用高通量miRNAs芯片技术筛选肿瘤诱导过的淋巴管内皮细胞和未处理的淋巴管内皮细胞差异表达的miRNAs,采用荧光实时定量PCR技术对部分候选人胃癌淋巴管生成相关miRNA在有无淋巴结转移的胃癌组织中进行初步验证。结果：1.通过qRT-PCR及Western Blot检测结果表明：在实验选取的六种不同类型的人胃癌细胞中均可检测VEGF-C mRNA及蛋白的表达,但其中MKN-45中表达相对最低,而SGC-7901中表达相对最高；2.构建VEGF-C过表达慢病毒载体,并对MKN-45细胞成功进行感染：荧光显微镜观察其效率可达90%以上,且在基因及蛋白水平分别进行验证；3.淋巴管内皮细胞管形成实验显示：收集实验组、对照组和空白组细胞的培养上清,分别加入淋巴管内皮细胞的培养体系中,观察其小管的形成数目及小管长度分别也存在统计学意义(P0.05)；4.高通量microRNAs芯片：肿瘤诱导过的淋巴管内皮细胞和未处理的淋巴管内皮细胞miRNA表达谱中发现89个miRNAs表达水平有显著差异,其中47个miRNA表达上调,42个niRNA表达下调；5.应用qRT-PCR方法鉴定RNA芯片筛选的部分miRNAs:通过对收集的有淋巴结转移胃癌组织与无淋巴结转移胃癌组织对比分析发现,]miR-648, miR-5002-3p, miR-4754, miR-4760-5p, miR-4491, miR-4252, miR-5007-3p及miR-647表达上调,miR-3178, miR-593-5p, miR-4485, miR-135a-3p, miR-17, miR-1469及miR-124-5p表达下调,同芯片结果较为一致。结论：1.体外胃癌促淋巴管生成模型建立成功；2.明确胃癌细胞VEGF-C基因高表达促进淋巴管新生能力；3.胃癌淋巴道转移相关miRNAs的筛选及部分鉴定。
【关键词】：胃肿瘤 血管内皮生长因子-C 淋巴管生成 微小RNA
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 符号说明12-13
• 第一部分 VEGF-C基因促进胃癌淋巴管形成实验研究13-38
• 前言13-14
• 材料与方法14-30
• 结果30-13
• 讨论13-35
• 小结35-36
• 参考文献36-38
• 第二部分 胃癌淋巴管形成相关miRNA高通量筛选和鉴定研究38-54
• 前言38-39
• 材料与方法39-46
• 结果46-39
• 讨论39-52
• 结论52
• 参考文献52-54
• 综述54-64
• 参考文献58-64
• 致谢64-65
• 攻读博士学位期间发表的学术论文65-66
• 附件66-93

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本文编号：331034