基于金纳米簇的肿瘤活体多模态分子影像研究

发布时间：2017-04-27 18:14

本文关键词：基于金纳米簇的肿瘤活体多模态分子影像研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【研究背景和目的】自发荧光成像是近些年分子成像研究的新热点。自发荧光成像最重要的特点就是不需要额外的激发光,因而与传统荧光成像相比,具有明显的成像优势。首先,自发荧光成像由于无激发光,因此避免了背景荧光、非特异荧光对成像造成的背景干扰。其次,由于生物组织对光的吸收和散射,荧光成像的入射激发光在经过人体时不可避免的会发生强度的减弱。而自发荧光成像由于不需要激发光,因而避免了激发光减弱对成像效果造成的影响。目前,自发荧光成像的研究相对较少,成像原理多是基于能量共振转移原理。量子点则是目前唯一报道的自发荧光能量受体。然而,量子点一般是由Cd2+、Pb2+等重金属组成,而且很容易发生细胞内的聚集。特别是其内部的重金属粒子的不断自发释出,会对生物体及环境带来的潜在损害。由于毒性的限制,量子点很难进一步在生物医学领域发挥更大作用。因此人们急切需要研发一种全新、无毒、高生物相容性的自发荧光系统,进一步推动自发荧光成像及其在分子成像和治疗中的应用。金纳米簇是一种新型的荧光纳米材料。由于荧光稳定,安全性高,生物相容性好,水溶性佳等特点,日渐成为在体成像和探针研发中的新热点。然而目前尚无有关金纳米簇作为自发荧光成像能量供体的相关研究。本课题将首次利用人血清白蛋白作为模版合成近红外荧光金纳米簇,并首次建立金纳米簇的快速放射性标记方法。在此基础上,通过体内,体外一系列实验,评价金纳米簇与放射性核素间发生契伦科夫能量共振转移的可能性,并探讨金纳米簇作为契伦科夫能量共振转移受体和核素载体,实现自发荧光成像和放射性核素成像的潜在价值,从而为Au NCs成为新型多模态成像的候选分子提供理论依据。【方法】1.以用HSA为模版合成Au NCs,TEM测量其大小,荧光分光光度计测量其荧光光谱,CD谱测量HSA构象改变。以水合肼还原法,将放射性64Cu以无金属螯合物的方式还原于Au NCs表面,快速薄层层析(Instant Thin-Layer Chromatography,ITLC)测量其标记率和稳定性;2.体外评价64Cu-doped Au NCs的PET成像及其契伦科夫能量共振转移下的自发近红外荧光成像能力(CRET-NIR)。进一步采用IVIS分析其近红外自发光特点,选取如下滤光片组:无滤片组、590 nm、510 nm、515-575 nm、575-650 nm、695-770 nm和810-875 nm,对64Cu-doped Au NCs CRET-NIR的成像效果进行分析;3.裸鼠皮下接种U87MG细胞,尾静脉注射64Cu-doped Au NCs,分别使用PET成像和IVIS小动物成像系统,在注射后不同时间点,行PET成像及CRET-NIR成像,判断其在体双模态成像能力。以肿瘤部位为感兴趣区,计算不同时间点肿瘤部位的CRET-NIR和PET信号的变化,并判断二者关系;4.生物学分布实验及组织学检查,判断64Cu-doped Au NCs的靶向性,确定其体内代谢特点。【结果】1.成功合成了HSA包裹的Au NCs。TEM显示所合成的Au NCs呈规则球形颗粒,粒径均一,颗粒大小约为0.93±0.25 nm,分光光度计测量Au NCs最大发射光谱约为680 nm,CD谱测量结果证实,合成后HSA的空间构象得到保持。ITLC结果显示放射性64Cu几乎全被成功标记于Au NCs上,且标记稳定;2.体外PET成像及荧光成像结果显示,64Cu-doped Au NCs展现出良好双模态成像能力。IVIS系统对成像结果分析表明,64Cu-doped Au NCs可发生CRET-NIR成像,且强度高于64Cu的契伦科夫辐射。在无滤片组,64Cu-doped Au NCs的总信号强度是同放射强度64Cu Cl2的1.6倍;在590 nm组,64Cu-doped Au NCs强度值为9.40×106 photon/s远高于64Cu Cl2的3.42×106 photon/s(约2.7倍)。特别是在695-770 nm处,由于包含64Cu-doped Au NCs的最大发射波长,荧光强度是64Cu Cl2契伦科夫辐射强度的4.3倍;3.荷瘤动物在体成像表明,64Cu-doped Au NCs具备优良的PET成像及CRET-NIR成像性能。PET成像及定量结果显示,64Cu-doped Au NCs在注射后1小时即有明显的肿瘤摄取。ROI测量显示,随着时间延长,在注射后18小时和24小时,肿瘤组织可分别达到14.9%ID/g和15.2%ID/g的放射性摄取。IVIS成像表明64Cudoped Au NCs可显示出满意的肿瘤CRET-NIR,注射后8小时达最大信号值。与此对应的是,同等放射剂量的64Cu Cl2的契伦科夫辐射却基本不能显示肿瘤位置。ROI测量64Cu Cl2契伦科夫辐射强度仅为64Cu-doped Au NCs在体强度的1/7;由于CRET现象,在体PET与CRET-NIR信号显示出良好的线性相关性,其中PET与无滤片组和590 nm组的相关性分别达到r2=0.9340和r2=0.9687。然而,由于契伦科夫辐射能量发生了转移,510 nm组中64Cu Cl2的契伦科夫辐射与PET信号的相关性仅为r2=0.7616;4.生物分布实验结果显示,64Cu-doped Au NCs具有良好的体内动力学特点,肝脏和肾脏是其排泄器官,组织学检查没有发现明显的器官损伤。【结论】本课题成功制备了新型自发成像金纳米簇,64Cu-doped Au NCs,首次将贵金属纳米簇作为能量受体,成功用于小动物PET和CRET-NIR双模态成像。该探针具有以下特点:1)粒径小,水溶性好,稳定性高;2)具备PET及自发NIR双模态成像的能力;3)可将短波长的契伦科夫辐射转化为Au NCs的长波长,有利于在体成像;4)在体无毒,且生物相容性好。64Cu-doped Au NCs有望成为生物医学,特别是分子影像与肿瘤治疗研究的新利器。
【关键词】：金纳米簇 64Cu 契伦科夫能量共振转移 自发荧光成像 PET成像 近红外成像
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.4;O482.31
【目录】：

缩略语表7-10
中文摘要10-14
ABSTRACT14-19
前言19-22
文献回顾22-39
1. 肿瘤的流行病学、诊断及治疗现状和所面临的挑战22
2. 分子影像学在肿瘤相关研究中的作用22-24
3. 分子影像研究朝向多模态方向发展24-26
4. 核素光学双模态分子成像具有明显的成像优势26-31
5. 纳米材料与多模态分子成像31-33
6. 金纳米簇的研究背景33-37
7. 结语37-39
第一部分金纳米簇的合成、表征及放射性标记39-55
1. 材料40-41
1.1 试剂与耗材40
1.2 实验仪器40-41
2. 方法41-44
2.1 HSA@Au NCs的合成41-42
2.2 放射性~(64)Cu标记与纯化42
2.3 ~(64)Cu-doped Au NCs的放射化学纯度测定42
2.4 不同浓度Cu制备Cu-doped Au NCs42-43
2.5 琼脂糖凝胶电泳43
2.6 不同浓度Cu制备的Cu-doped Au NCs荧光性质的影响43-44
2.7 统计分析方法44
3. 结果44-52
3.1 HSA@Au NCs的合成44
3.2 Au NCs吸收光谱及荧光光谱44-46
3.3 Au NCs的形貌及粒径表征、46
3.4 Cu-doped Au NCs的吸收光谱及荧光光谱表征46
3.5 Cu-doped Au NCs的形貌、粒径表征及CD谱变化46-47
3.6 ~(64)Cu标记Au NCs的效率、纯度及稳定性47-49
3.7 不同浓度Cu制备Cu-doped Au NCs及其对Au NCs荧光特性的影响49-52
4. 讨论52-55
第二部分 ~(64)CU-DOPED AUNCS的体外多模态成像研究与评价55-72
1. 材料56-57
1.1 试剂与耗材56-57
1.2 实验仪器57
1.3 细胞系57
2. 方法57-62
2.1 细胞复苏、培养穿代、冻存57-58
2.2 细胞计数58-59
2.3 CCK8毒性实验59-60
2.4 细胞非特异吞噬及免疫荧光60
2.5 细胞非特异吞噬的流式细胞仪检测60-61
2.6 体外PET成像61
2.7 体外Maestro成像61
2.8 体外契伦科夫能量共振转移成像及IVIS光谱分段分析扫描61-62
2.9 统计分析方法62
3. 结果62-69
3.1 CCK8细胞毒性研究62-63
3.2 U87MG细胞对纳米粒子的摄取及流式63-64
3.3 ~(64)Cu-doped Au NCs体外PET成像评估64-65
3.4 ~(64)Cu-doped Au NCs体外Maestro荧光成像评估65-66
3.5 体外自发荧光成像及IVIS光谱分段扫描66-69
4. 讨论69-72
第三部分 ~(64)CU-DOPED AUNCS的体内多模态成像研究与评价72-91
1. 材料73-74
1.1 试剂与耗材73
1.2 实验仪器73-74
1.3 细胞系及实验动物74
2. 方法74-77
2.1 荷瘤动物模型建立74-75
2.2 ~(64)Cu-doped Au NCs荷瘤动物的PET成像75
2.3 ~(64)Cu-doped Au NCs荷瘤动物的自发荧光及契伦科夫成像75-76
2.4 ~(64)Cu-doped Au NCs的器官分布76
2.5 PET成像与光学成像的相关性分析76-77
2.6 ~(64)Cu-doped Au NCs组织学评价77
2.7 统计分析方法77
3. 结果77-88
3.1 ~(64)Cu-doped Au NCs的近红外自发荧光成像77-80
3.2 ~(64)Cu-doped Au NCs的PET成像80-83
3.3 PET成像与光学成像的相关性83-85
3.4 ~(64)Cu-doped Au NCs的器官分布85-86
3.5 器官毒性研究86-88
4. 讨论88-91
小结91-92
参考文献92-113
个人简历和研究成果113-117
致谢117-118

【共引文献】

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