aPKCι与Nrf2竞争性结合Keap1促进胆囊癌细胞成瘤和吉西他滨耐药
发布时间：2021-08-02 03:29
第一部分aPKCι促进Nrf2蛋白累积并抑制胆囊癌细胞内ROS水平目的:研究在正常条件下和氧化应激状态下aPKCι对胆囊癌细胞内ROS水平的调节作用,初步探讨aPKCι与Nrf2蛋白表达的相关性。方法:构建aPKCι过表达和靶向沉默的慢病毒载体,分别感染胆囊癌细胞NOZ和GBC-SD以获得稳定细胞株。采用western blot和qRT-PCR方法检测各组稳定细胞中aPKCι的蛋白质和m RNA表达水平。采用DCFH-DA探针法检测不同aPKCι表达水平或吉西他滨处理后的胆囊癌细胞内ROS水平的变化。检测aPKCι激酶抑制剂PSI对aPKCι活性和Nrf2蛋白水平的影响。构建携带Flag标签的激酶失活型（KI）、持续激活的催化结构域（CAT）突变体,采用western blot方法检测各组细胞中总Nrf2蛋白和磷酸化Nrf2蛋白的表达。再运用western blot和qRT-PCR方法检测aPKCι对Keap1、Nrf2及其下游靶基因表达的影响。分别提取各组稳定细胞中的浆蛋白与核蛋白,检测aPKCι、Keap1、Nrf2蛋白在细胞浆、细胞核内的分布。在aPKCι过表达胆囊癌细胞中靶向沉...
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
A-B：DCFH-DA法检测胆囊癌细胞内ROS水平的变化，**P<0.01
华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文式—磷酸化 aPKC （p-aPKC ） 的表达水平逐渐降低，而总 aPKC （T-aPKC ）表达水平无明显变化。此外，我们还发现 p-Nrf2 和 T-Nrf2 亦无明显变化。但是，Ect2—一种 aPKC 的底物[18, 19]—磷酸化水平（p-Ect2）被抑制，且总 Ect2（T-Ect2）无明显改变。这表明本研究中 PSI 的确抑制了 aPKC 的激酶活性（图 1-3-C）。为了进一步证实 aPKC 调控 Nrf2 蛋白富集是否与其激酶活性有关，我们构建了携带 Flag 标签的 aPKC 野生型（wide type, WT）、激酶失活型（kinase-inactive，KI）、持续激活的催化结构域（constitutively active catalytic domain，CAT）载体转染至胆囊癌细胞。WB 检测结果显示，与空白对照组比较，WT、KI 及 CAT组细胞中p-Nrf2蛋白显影仍然微弱且无明显变化，而T-Nrf2蛋白则升高（图1-3-D，E）。因此，上述结果表明 aPKC 可能以非激酶依赖的方式参与调控抗氧化反应。
图 1-4.A：Western blot 检测 aPKC 对 Nrf2、Keap1 蛋白表达的影响。B：qRT-PCR 检测 aPKC 对 Nrf2、Keap1 mRNA 表达的影响。C：Western blot 检测 aPKC 对 Nrf2、Keap1 蛋白在细胞浆/核内分布的影响。D：qRT-PCR检测aPKC 对Nrf2靶基因mRNA水平的影响，*P<0.05，**P<0.01。5. aPKCι 通过 Nrf2 介导的抗氧化应激信号调控胆囊癌细胞内的 ROS 水平接下来，我们继续研究 aPKC 是否通过 Nrf2 介导的抗氧化反应调控胆囊癌细胞内 ROS 水平。首先我们筛选了敲低内源性 Nrf2 的 siRNA 序列，并经 WB验证靶向沉默 Nrf2 的有效性（图 1-5-A）。然后将阴性对照 siRNA（si-neg）与si-Nrf2 分别转染至过表达 aPKC 的胆囊癌细胞。采用 DCFH-DA 法检测细胞内ROS 水平的变化。结果显示，抑制 Nrf2 表达后，完全逆转了过表达 aPKC 对细胞内 ROS 水平的抑制作用（图 1-5-B）。这提示 aPKC 可能是通过 Nrf2 介导的抗氧化信号通路调控胆囊癌细胞内的 ROS 水平。
【参考文献】：
期刊论文
[1]全国胆囊癌临床流行病学调查报告[J]. 邹声泉,张林. 中国实用外科杂志. 2000(01)
本文编号：3316799
【文章来源】：华中科技大学湖北省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：103 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
A-B：DCFH-DA法检测胆囊癌细胞内ROS水平的变化，**P<0.01
华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文式—磷酸化 aPKC （p-aPKC ） 的表达水平逐渐降低，而总 aPKC （T-aPKC ）表达水平无明显变化。此外，我们还发现 p-Nrf2 和 T-Nrf2 亦无明显变化。但是，Ect2—一种 aPKC 的底物[18, 19]—磷酸化水平（p-Ect2）被抑制，且总 Ect2（T-Ect2）无明显改变。这表明本研究中 PSI 的确抑制了 aPKC 的激酶活性（图 1-3-C）。为了进一步证实 aPKC 调控 Nrf2 蛋白富集是否与其激酶活性有关，我们构建了携带 Flag 标签的 aPKC 野生型（wide type, WT）、激酶失活型（kinase-inactive，KI）、持续激活的催化结构域（constitutively active catalytic domain，CAT）载体转染至胆囊癌细胞。WB 检测结果显示，与空白对照组比较，WT、KI 及 CAT组细胞中p-Nrf2蛋白显影仍然微弱且无明显变化，而T-Nrf2蛋白则升高（图1-3-D，E）。因此，上述结果表明 aPKC 可能以非激酶依赖的方式参与调控抗氧化反应。
图 1-4.A：Western blot 检测 aPKC 对 Nrf2、Keap1 蛋白表达的影响。B：qRT-PCR 检测 aPKC 对 Nrf2、Keap1 mRNA 表达的影响。C：Western blot 检测 aPKC 对 Nrf2、Keap1 蛋白在细胞浆/核内分布的影响。D：qRT-PCR检测aPKC 对Nrf2靶基因mRNA水平的影响，*P<0.05，**P<0.01。5. aPKCι 通过 Nrf2 介导的抗氧化应激信号调控胆囊癌细胞内的 ROS 水平接下来，我们继续研究 aPKC 是否通过 Nrf2 介导的抗氧化反应调控胆囊癌细胞内 ROS 水平。首先我们筛选了敲低内源性 Nrf2 的 siRNA 序列，并经 WB验证靶向沉默 Nrf2 的有效性（图 1-5-A）。然后将阴性对照 siRNA（si-neg）与si-Nrf2 分别转染至过表达 aPKC 的胆囊癌细胞。采用 DCFH-DA 法检测细胞内ROS 水平的变化。结果显示，抑制 Nrf2 表达后，完全逆转了过表达 aPKC 对细胞内 ROS 水平的抑制作用（图 1-5-B）。这提示 aPKC 可能是通过 Nrf2 介导的抗氧化信号通路调控胆囊癌细胞内的 ROS 水平。
【参考文献】：
期刊论文
[1]全国胆囊癌临床流行病学调查报告[J]. 邹声泉,张林. 中国实用外科杂志. 2000(01)
本文编号：3316799
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/3316799.html
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