促进α-synuclein寡聚体解聚或降解的化合物筛选平台建立及FY-017、CA抗帕金森症研究
发布时间：2021-08-08 20:54
帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是仅次于老年痴呆症的第二大神经退行性疾病。1997年,在家族性PD患者脑内首次发现A53T突变型α-synuclein,它是最早被发现与PD相关的致病蛋白。A53T点突变会增加α-synuclein的表达,增加α-synuclein的错误折叠,形成更多的毒性聚集体。大量研究表明,在散发性PD患者脑内也检测到α-synuclein为主要成分的路易小体沉积。α-synuclein的异常在PD早期发生和病程发展中扮演了重要的角色,α-synuclein异常聚集出现早于PD典型运动症状,阻断α-synuclein的聚集应能减缓PD病程发展和改善症状。以α-synuclein或其寡聚体作为PD发病早期的临床生物学标志物,寻找更多的能够有效降低α-synuclein寡聚体的化合物,对PD的治疗具有重要的意义。萤光素酶的蛋白片段互补分析（Protein-fragment Complementation Assays,PCA）和双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC）的方法被广泛...
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)上海市
【文章页数】：137 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
靶向毒性α-synuclein治疗策略[60]
第1章引言101.5科学问题与研究意义A53T突变型α-synuclein是第一个被发现的与PD相关的致病蛋白[8]。PD早期发生和病程发展中α-synuclein的异常扮演了重要的角色，研究发现α-synuclein异常聚集出现早于PD典型运动症状（图1.3）[5,65]，阻断α-synuclein的聚集应能减缓PD病程发展和改善症状，提高患者的生存质量。化合物筛选是新药研发非常关键的环节。建立高通量的化合物筛选平台并找到更多能够有效降低α-synuclein寡聚体的化合物，对PD的治疗具有重要意义。本课题将以α-synuclein为靶向，进行抗PD化合物的筛选和研究。图1.3PD病理学分期[65]Figure1.3SixstagesofPDpathology根据α-synuclein在脑内的病理分布可分为六个分期。随着病程发展，已受影响的脑内病理会进一步恶化，并且α-synuclein会扩散到新的脑区域。a.α-synuclein的病理发展过程（箭头）。可变的红色阴影反映了疾病的病程以及病理的严重程度；b.第1阶段：病变发生在嗅球、前嗅核、或脑干的迷走神经和舌咽神经的背侧运动核。第2阶段：在脑桥被盖区（蓝斑，网状结构的大细胞核和下缝核）中观察到病变；c.第3阶段和第4阶段：病变到达脚桥核，基底前脑的胆碱能大细胞核，黑质致密区（第3阶段），下丘脑，以及颞叶内侧中间皮质（阶段4）。PD的最初临床症状出现在3期或4期早期；d.阶段5和6：病变到达新皮层高级相关区域（阶段5），然后是一级相关区域和初级区域（阶段6）。5、6期属于临床中晚期。
第1章引言111.6课题研究路线与方法为找到更多有效减少α-synuclein寡聚体的活性化合物并对其进行体内体外水平的药理学研究，本课题主要从以下两个方面进行展开：1.根据蛋白片段互补分析原理，建立促进α-synuclein寡聚体解聚或降解的化合物筛选平台（图1.4）。将具有萤光活性的Gaussia萤光素酶在第93位氨基酸位点进行剪切拆成N端和C端两部分序列[66]，分别与A53T突变（A53Tα-synuclein）序列接合构建一对质粒。SH-SY5Y细胞中转染质粒后，A53Tα-synuclein的相互作用可使Gaussia萤光素酶恢复生物活性，A53Tα-synuclein寡聚体形成越少，Gaussia萤光素酶的报告活性也越低。利用Gaussia萤光素酶蛋白片段互补分析平台，筛选候选化合物。另外，建立Venus荧光蛋白互补分析平台，将荧光蛋白Venus的N端（第173位氨基酸位点剪切）和C端序列（第155位氨基酸位点剪切）[67],分别与A53T突变序列接合构建一对质粒。在细胞中转染质粒后，通过荧光显微镜（Ex=515nm/Em=528nm）直接观察黄色荧光蛋白Venus，间接表示细胞内A53Tα-synuclein寡聚体的形成。同时检测化合物处理后的细胞毒性，以排除因化合物细胞毒性而造成的筛选假阳性结果。优化实验条件并确定阳性对照化合物。图1.4化合物筛选平台构建的研究路线Figure1.4Researchroutesofestablishingcompoundsscreeningplatforms
本文编号：3330663
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)上海市
【文章页数】：137 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
靶向毒性α-synuclein治疗策略[60]
第1章引言101.5科学问题与研究意义A53T突变型α-synuclein是第一个被发现的与PD相关的致病蛋白[8]。PD早期发生和病程发展中α-synuclein的异常扮演了重要的角色，研究发现α-synuclein异常聚集出现早于PD典型运动症状（图1.3）[5,65]，阻断α-synuclein的聚集应能减缓PD病程发展和改善症状，提高患者的生存质量。化合物筛选是新药研发非常关键的环节。建立高通量的化合物筛选平台并找到更多能够有效降低α-synuclein寡聚体的化合物，对PD的治疗具有重要意义。本课题将以α-synuclein为靶向，进行抗PD化合物的筛选和研究。图1.3PD病理学分期[65]Figure1.3SixstagesofPDpathology根据α-synuclein在脑内的病理分布可分为六个分期。随着病程发展，已受影响的脑内病理会进一步恶化，并且α-synuclein会扩散到新的脑区域。a.α-synuclein的病理发展过程（箭头）。可变的红色阴影反映了疾病的病程以及病理的严重程度；b.第1阶段：病变发生在嗅球、前嗅核、或脑干的迷走神经和舌咽神经的背侧运动核。第2阶段：在脑桥被盖区（蓝斑，网状结构的大细胞核和下缝核）中观察到病变；c.第3阶段和第4阶段：病变到达脚桥核，基底前脑的胆碱能大细胞核，黑质致密区（第3阶段），下丘脑，以及颞叶内侧中间皮质（阶段4）。PD的最初临床症状出现在3期或4期早期；d.阶段5和6：病变到达新皮层高级相关区域（阶段5），然后是一级相关区域和初级区域（阶段6）。5、6期属于临床中晚期。
第1章引言111.6课题研究路线与方法为找到更多有效减少α-synuclein寡聚体的活性化合物并对其进行体内体外水平的药理学研究，本课题主要从以下两个方面进行展开：1.根据蛋白片段互补分析原理，建立促进α-synuclein寡聚体解聚或降解的化合物筛选平台（图1.4）。将具有萤光活性的Gaussia萤光素酶在第93位氨基酸位点进行剪切拆成N端和C端两部分序列[66]，分别与A53T突变（A53Tα-synuclein）序列接合构建一对质粒。SH-SY5Y细胞中转染质粒后，A53Tα-synuclein的相互作用可使Gaussia萤光素酶恢复生物活性，A53Tα-synuclein寡聚体形成越少，Gaussia萤光素酶的报告活性也越低。利用Gaussia萤光素酶蛋白片段互补分析平台，筛选候选化合物。另外，建立Venus荧光蛋白互补分析平台，将荧光蛋白Venus的N端（第173位氨基酸位点剪切）和C端序列（第155位氨基酸位点剪切）[67],分别与A53T突变序列接合构建一对质粒。在细胞中转染质粒后，通过荧光显微镜（Ex=515nm/Em=528nm）直接观察黄色荧光蛋白Venus，间接表示细胞内A53Tα-synuclein寡聚体的形成。同时检测化合物处理后的细胞毒性，以排除因化合物细胞毒性而造成的筛选假阳性结果。优化实验条件并确定阳性对照化合物。图1.4化合物筛选平台构建的研究路线Figure1.4Researchroutesofestablishingcompoundsscreeningplatforms
本文编号：3330663
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