肝再生增强因子增强脂肪肝抵抗缺血/再灌注损伤及机制研究

发布时间：2021-08-11 00:59

　　背景和目的:对于肝脏肿瘤、终末期肝病等肝脏疾病而言,肝部分切除术和肝移植术已成为一种常规且有效的治疗方法。随着人们生活水平的提升和生活方式的改变,肥胖已经成为一个全球普遍的现象,随之而来的是非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）发病率的快速增加。NAFLD的高发病率,导致符合要求的正常供肝越来越少。等待肝脏移植的患者与器官供应短缺之间的矛盾日渐严峻,促使脂肪肝作为一个边缘供肝在临床上越来越多的被应用。在临床工作中,脂肪肝接受肝脏手术,如肝部分切术,也越来越普遍。与正常肝脏相比,脂肪肝更容易遭受脂质过氧化损伤,对缺血/再灌注损伤（ischemia/reperfusion injury,IRI）的敏感性升高、耐受性降低,是影响肝部分切除术和肝移植术后死亡率的一个重要因素。肝再生增强因子（augmenter of liver regeneration,ALR）,最初是从初断乳大鼠的肝脏或肝部分切除大鼠的肝脏中提取出一种蛋白,可以促进肝脏再生。后来研究发现ALR对多种不同类型的肝脏损伤亦具有保护作用。最近研究表明ALR与肝脏IRI亦... 

【文章来源】：首都医科大学北京市

【文章页数】：156 页

【学位级别】：博士

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中文摘要
Abstract
前言
材料与方法
    1、实验材料
        1.1 材料及来源
        1.2 主要仪器
        1.3 常用液体的配制
    2、实验方法
        第一部分：建立小鼠脂肪肝模型，并进行肝脏缺血/再灌注损伤（IRI），观察过表达ALR对肝脏IRI有无保护作用
            2.1 确定ALR重组腺病毒载体注射剂量及注射时间
            2.2 观察腺病毒对肝细胞有无损伤作用
            2.3 建立脂肪肝小鼠肝脏IRI模型
            2.4 标本收集
            2.5 肝组织TG含量检测
            2.6 油红O染色观察肝细胞内TG堆积情况
            2.7 观察外源性ALR基因在肝组织中的表达情况
            2.8 血清学指标检测
            2.9 苏木素-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色观察肝组织学形态变化
            2.10 检测脂肪肝小鼠IRI后肝细胞的凋亡水平
            2.11 肝组织脂质过氧化产物测定
            2.12 检测脂肪肝小鼠肝脏IRI后肝脏的抗氧化能力
            2.13 肝组织中ATP水平检测
            2.14 检测脂肪肝IRI后肝组织内的炎症反应
            2.15 IHC法检测肝组织中增殖细胞核抗原 (Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA) 表达水平
        第二部分：脂肪变HepG2细胞缺氧/复氧（H/R）损伤模型建立及ALR对其保护作用研究
            2.16 建立稳定转染ALR-pcDNA 3.0 和Vector-pcDNA 3.0 的HepG2细胞系
            2.17 ALR-Tx和Vector-Tx细胞系培养
            2.18 用OA/PA混合液诱导ALR-Tx和Vector-Tx细胞脂肪变性
            2.19 检测OA/PA混合液诱导后细胞脂变情况
            2.20 建立细胞H/R损伤模型
            2.21 脂变细胞H/R损伤后细胞活力检测（CCK8实验）
            2.22 观察脂变细胞H/R损伤后细胞凋亡情况
            2.23 检测脂变细胞H/R损伤后细胞内总ROS含量
        第三部分：探讨ALR高表达对脂肪肝小鼠肝脏IRI保护的可能机制
            2.24 脂变细胞H/R损伤后线粒体相关功能检测
            2.25 脂变细胞H/R损伤后的细胞抗氧化能力检测
            2.26 统计学分析
实验结果
    第一部分：建立脂肪肝小鼠肝脏IRI模型，观察过表达ALR对肝脏IRI的保护作用
        1. 构建AD-FLAG-ALR腺病毒载体
        2. C57BL/6 小鼠脂肪肝模型的建立
        3. ALR重组腺病毒在脂肪肝小鼠肝脏内高效表达ALR蛋白
        4. 腺病毒注射3天对肝功能无明显影响
        5. ALR减轻脂肪肝小鼠肝脏IRI后肝功能损害
            5.1 ALR降低血清中ALT，AST，LDH水平
            5.2 ALR保护脂肪肝小鼠抵御肝脏IRI打击的组织学证据
        6. ALR抑制脂肪肝小鼠IRI导致的肝细胞凋亡
            6.1 ALR改变肝组织中凋亡相关蛋白Bcl-2, Bax和cleaved Caspase-3 的表达水平
            6.2 ALR减少肝组织中cleaved Caspase-3 阳性细胞数量
            6.3 ALR减少肝组织中TUNEL阳性细胞数
        7. ALR减轻肝细胞脂质过氧化反应
            7.1 ALR减少脂肪肝组织内MDA含量
            7.2 ALR降低脂肪肝组织中 4-HNE表达水平
        8. ALR提高肝细胞抗氧化能力
        9. ALR治疗组动物经受肝脏IRI打击后肝组织ATP含量改变
        10. ALR抑制脂肪肝IRI的炎症反应
            10.1 ALR降低炎症因子TNF-a, IL-1b, IL-6 和趋化因子CXCL2的mRNA水平
            10.2 ALR抑制肝组织KCs活化
        11. ALR促进脂肪肝IRI后的细胞增殖
    第二部分：脂肪变HepG2细胞缺氧/复氧（H/R）损伤模型建立及ALR对其保护作用研究
        12. 外源性ALR基因在HEPG2细胞内稳定表达
            12.1 构建含ALR基因的pcDNA3.0 质粒
            12.2 建立稳定高表达ALR蛋白的HepG2细胞
        13. OA/PA混合液诱导HEPG2细胞脂肪变
            13.1 脂变细胞内脂滴堆积明显
            13.2 脂变细胞内TG含量明显增高
        14. ALR提高脂变细胞H/R损伤后的细胞活力
        15. ALR抑制脂变细胞H/R损伤后的细胞凋亡
            15.1 ALR降低脂变细胞H/R损伤后的Caspase-3 活性
            15.2 ALR促进脂变细胞H/R损伤后凋亡相关蛋白Bcl-2 的表达
            15.3 ALR降低脂变细胞H/R损伤后的TUNEL阳性细胞数
        16. ALR抑制细胞ROS的产生
    第三部分：探讨ALR保护脂肪肝小鼠肝脏IRI的可能机制
        17. ALR保护H/R损伤细胞的线粒体功能
            17.1 ALR抑制H/R损伤细胞线粒体ROS产生
            17.2 ALR稳定细胞H/R损伤后线粒体膜电位
            17.3 ALR增强脂变细胞H/R损伤后线粒体氧化磷酸化反应
            17.4 ALR提高脂变细胞H/R损伤后的ATP含量
        18. ALR增强H/R损伤细胞的抗氧化能力
            18.1 ALR增强H/R损伤细胞的SOD活性
            18.2 ALR提高细胞MnSOD蛋白表达水平
            18.3 ALR增强MnSOD转录水平
            18.4 ALR增强H/R损伤细胞的GSH活性
讨论
结论
参考文献
文献综述
    参考文献
英文缩略词表
攻读学位期间发表文章情况
致谢
个人简历



本文编号：3335123