基于蛋白质组学技术的磷酸化修饰和酰化修饰交互调控的机制与功能研究
发布时间：2021-08-19 07:31
蛋白质翻译后修饰是对蛋白质结构和功能的精细调节,是细胞生命活动中关键的调控机制。越来越多的证据表明翻译后修饰之间存在交互调控,并且这种交互调控可以精巧地调控复杂的细胞信号转导网络。磷酸化修饰是生命活动中最普遍也是研究最广泛的翻译后修饰,但是目前磷酸化修饰和酰化修饰交互调控的全局性认识仍然匮乏。本文利用基于质谱的蛋白质组学技术通量大、灵敏度高、定量准确性高的优势,对磷酸化修饰和酰化修饰以及磷酸化修饰和泛素化修饰之间的交互调控进行了深入的探讨。首先对AMPK（Adenosine 5‘-monophosphate-activated protein kinase）介导的磷酸化在DNA损伤反应中的分子机制,以及其与组蛋白乙酰化修饰之间的交互调控在其中的功能进行了探究。AMPK介导的磷酸化被广泛认为是能量代谢调控的核心,但是其在肿瘤细胞中的角色仍不明确。有研究显示AMPK可以通过调控DNA损伤反应参与肿瘤发生发展过程,而DNA损伤修复需要组蛋白修饰介导的染色质调节。基于此,我们首先利用TALENs（Transcription activator-like effector nucleases）技...
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)上海市
【文章页数】：141 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
基于MOAC磷酸化肽段富集原理[57]
基于蛋白质组学技术的磷酸化修饰和酰化修饰交互调控的机制与功能研究8磷酸化肽段的富集。在SCX中，强酸性的磷酸化肽段和阴离子固定相结合较弱，可以从色谱柱中流出；在SAX中，强酸性的磷酸化肽段和阳离子固定相结合较强，保留在色谱柱的固定相上。因此，在这两种IEC的方法中，都可以实现磷酸化肽段和非磷酸化肽段的分离，从而达到富集的效果。但是由于肽段自身的电荷状态非常复杂，酸性的侧链残基和赖氨酸（K）、精氨酸（R）电荷中和后，会进一步降低IEC对于磷酸化肽段的区分能力。此外IEC自身的分离能力也较差，所以一般IEC主要和IMAC或MOAC结合，提供多一个维度的分离，降低单个组分中样品的复杂程度，从而提高磷酸化肽段的鉴定深度。这种结合IEC和IMAC或MOAC的组合型策略是目前磷酸化蛋白质组学中应用最广泛的磷酸化肽段富集策略（图1.5）。图1.5SCX/IMAC磷酸化肽段富集组合型策略[61]Figure1.5SCX/IMACcombinationstrategyforphosphopeptideenrichment细胞经裂解后得到的蛋白混合物经过还原反应打开二硫键，并通过烷基化试剂封闭半胱氨酸的巯基侧链，然后通过胰酶酶切产生肽段，肽段混合物先通过SCX进行组分分离，再分别对每一个组分进行磷酸化肽段的富集，最后将洗脱下来的磷酸化肽段进行质谱分析。（5）亲水相互作用色谱富集法近些年来，亲水相互作用色谱（HydrophilicInteractionChromatography，HILIC）逐渐被视为SCX和SAX的替代方法。HILIC的流动相是水相缓冲液和有机溶剂，固定相是强吸水性的极性吸附。和反相色谱法（Reverse-phaseChromatography，RPC）相反，HILIC使用的洗脱梯度是从高有机相（如95%的乙腈）逐步降低到水相。分析物在HILIC中，根据亲水性的不同被分离，极性越强分析物保留时间
基于蛋白质组学技术的磷酸化修饰和酰化修饰交互调控的机制与功能研究18图1.11组蛋白翻译后修饰的结构[117]Figure1.11Structuresofhistonepost-translationalmodifications组蛋白上的不同的修饰类型以及修饰位点的组合通常称为组蛋白密码（histonecode），由组蛋白修饰酶（writer）、去修饰酶（eraser）调节。组蛋白上的各种翻译后修饰又可以被各类基因调控相关效应蛋白识别（reader），形成“阅读器-修饰”的识别配对，进一步调控基因的表达[113]。组蛋白翻译后修饰的异常调控和许多疾病密切相关[118]。1.2.3.2基于生物质谱的组蛋白修饰组学的研究方法在早期，组蛋白的翻译后修饰还无法通过先进的生物质谱检测。组蛋白翻译后修饰一般通过同位素标记和化学方法鉴定。例如，组蛋白乙酰化的验证过程：将乙酸钠-14C2与细胞或分离的核一起温育后，14C同位素迅速掺入组蛋白，表明14C同位素是由赖氨酸侧链上的乙酰化修饰或N端乙酰化引起的。并且嘌呤霉素不能抑制同位素的掺入表明该过程是在蛋白质合成后发生的[119]。进一步的通过进行组蛋白的氨基酸分析表明，乙酸盐-14C2可以掺入到乙酰赖氨酸上[120]。随着技术的发展，可以通过质谱根据候选修饰引起的假定质量变化来检测修饰。或者，可以开发针对目的组蛋白标记的序列独立性和序列特异性抗体，并通过蛋白质印迹分析和免疫染色将其用于探测组蛋白标记。芝加哥大学的YingmingZhao教授实验室发展了一套基于生物质谱的无偏向性查找新型组蛋白
本文编号：3350994
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)上海市
【文章页数】：141 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
基于MOAC磷酸化肽段富集原理[57]
基于蛋白质组学技术的磷酸化修饰和酰化修饰交互调控的机制与功能研究8磷酸化肽段的富集。在SCX中，强酸性的磷酸化肽段和阴离子固定相结合较弱，可以从色谱柱中流出；在SAX中，强酸性的磷酸化肽段和阳离子固定相结合较强，保留在色谱柱的固定相上。因此，在这两种IEC的方法中，都可以实现磷酸化肽段和非磷酸化肽段的分离，从而达到富集的效果。但是由于肽段自身的电荷状态非常复杂，酸性的侧链残基和赖氨酸（K）、精氨酸（R）电荷中和后，会进一步降低IEC对于磷酸化肽段的区分能力。此外IEC自身的分离能力也较差，所以一般IEC主要和IMAC或MOAC结合，提供多一个维度的分离，降低单个组分中样品的复杂程度，从而提高磷酸化肽段的鉴定深度。这种结合IEC和IMAC或MOAC的组合型策略是目前磷酸化蛋白质组学中应用最广泛的磷酸化肽段富集策略（图1.5）。图1.5SCX/IMAC磷酸化肽段富集组合型策略[61]Figure1.5SCX/IMACcombinationstrategyforphosphopeptideenrichment细胞经裂解后得到的蛋白混合物经过还原反应打开二硫键，并通过烷基化试剂封闭半胱氨酸的巯基侧链，然后通过胰酶酶切产生肽段，肽段混合物先通过SCX进行组分分离，再分别对每一个组分进行磷酸化肽段的富集，最后将洗脱下来的磷酸化肽段进行质谱分析。（5）亲水相互作用色谱富集法近些年来，亲水相互作用色谱（HydrophilicInteractionChromatography，HILIC）逐渐被视为SCX和SAX的替代方法。HILIC的流动相是水相缓冲液和有机溶剂，固定相是强吸水性的极性吸附。和反相色谱法（Reverse-phaseChromatography，RPC）相反，HILIC使用的洗脱梯度是从高有机相（如95%的乙腈）逐步降低到水相。分析物在HILIC中，根据亲水性的不同被分离，极性越强分析物保留时间
基于蛋白质组学技术的磷酸化修饰和酰化修饰交互调控的机制与功能研究18图1.11组蛋白翻译后修饰的结构[117]Figure1.11Structuresofhistonepost-translationalmodifications组蛋白上的不同的修饰类型以及修饰位点的组合通常称为组蛋白密码（histonecode），由组蛋白修饰酶（writer）、去修饰酶（eraser）调节。组蛋白上的各种翻译后修饰又可以被各类基因调控相关效应蛋白识别（reader），形成“阅读器-修饰”的识别配对，进一步调控基因的表达[113]。组蛋白翻译后修饰的异常调控和许多疾病密切相关[118]。1.2.3.2基于生物质谱的组蛋白修饰组学的研究方法在早期，组蛋白的翻译后修饰还无法通过先进的生物质谱检测。组蛋白翻译后修饰一般通过同位素标记和化学方法鉴定。例如，组蛋白乙酰化的验证过程：将乙酸钠-14C2与细胞或分离的核一起温育后，14C同位素迅速掺入组蛋白，表明14C同位素是由赖氨酸侧链上的乙酰化修饰或N端乙酰化引起的。并且嘌呤霉素不能抑制同位素的掺入表明该过程是在蛋白质合成后发生的[119]。进一步的通过进行组蛋白的氨基酸分析表明，乙酸盐-14C2可以掺入到乙酰赖氨酸上[120]。随着技术的发展，可以通过质谱根据候选修饰引起的假定质量变化来检测修饰。或者，可以开发针对目的组蛋白标记的序列独立性和序列特异性抗体，并通过蛋白质印迹分析和免疫染色将其用于探测组蛋白标记。芝加哥大学的YingmingZhao教授实验室发展了一套基于生物质谱的无偏向性查找新型组蛋白
本文编号：3350994
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