TRIM59在EGFR/EGFRvⅢ调控胶质母细胞瘤发生发展中的作用及机制研究
发布时间：2021-08-19 19:27
第一部分TRIM59抑制TC45去磷酸化STAT3促进EGFR/EGFRvⅢ胶质母细胞瘤发生发展目的:EGFR/EGFRvⅢ亚型胶质母细胞瘤致病因子和致病机制不明,本研究旨在探讨TRIM59在EGFR/EGFRvⅢ亚型胶质母细胞瘤发生发展中的作用及分子机制。方法:利用免疫组织化学染色检测胶质母细胞瘤组织中TRIM59的表达水平,并分析其表达与胶质母细胞瘤患者预后的关系;通过细胞增殖实验、软琼脂克隆形成实验和颅内原位移植瘤模型观察敲低TRIM59对EGFR/EGFRvⅢ胶质母细胞瘤生物学行为的影响;采用蛋白免疫印迹、实时荧光定量PCR和双荧光素酶报告基因实验检测EGFR/EGFRvⅢ对TRIM59表达的调控作用;利用RNA-Seq和基因富集分析检测敲低TRIM59对EGFR/EGFRvⅢ下游信号通路的影响;通过蛋白免疫印迹和免疫共沉淀技术探索TRIM59介导EGFR/EGFRvⅢ调控STAT3信号通路的分子机制。结果:TRIM59在胶质母细胞瘤中表达明显高于正常组织和低级别胶质瘤组织,高表达TRIM59的胶质母细胞瘤患者预后不良;敲低TRIM59明显抑制EGFR/EGFRvⅢ促进的胶质母...
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
TRIM59在胶质母细胞瘤中的表达量显著高于在其他组织中的表达量
上海交通大学博士学位论文27为了进一步证实上述结果，我们对GEO数据库（GDS1816）胶质母细胞瘤临床样本进行生存分析同样发现TRIM59高表达胶质母细胞瘤患者预后差（图2B）。图2.Kaplan-Meier法分析TRIM59表达与胶质母细胞瘤患者预后相关性。A.生存分析TRIM59高表达与低表达患者预后。B.生存分析GDS1816数据集TRIM59高表达与低表达患者预后。Figure2.Kaplan-MeieranalysisoftherelationshipglioblastomapatientsprognosiswithdifferentTRIM59expression.A.Kaplan–MeieranalysisofpatientswithhighTRIM59protein-expressingGBMversuslowTRIM59protein-expressingtumors.B.Kaplan–MeieranalysisofpatientswithhighTRIM59mRNA-expressingGBMversuslowTRIM59mRNA-expressingtumors.ExpressiondataofTRIM59mRNAweredownloadedfromtheGDS1816dataset.3.3EGFR激活上调TRIM59蛋白和mRNA水平为了证明TRIM59与EGFR的关系，我们首先对GEO数据库（GDS1816）进行分析，发现TRIM59在增殖型和间质型胶质母细胞瘤中高表达，而这两种亚型胶质母细胞瘤高表达EGFR，这提示EGFR与TRIM59表达存在正相关性（图3A）。为了进一步证实上述结果，我们首先在LN229和U87细胞中过表达EGFR组成型激活突变体EGFRvIII构建EGFR组成型激活稳定细胞系。然后，在LN229、LN229/EGFRvIII细胞和U87、U87/EGFRvIII细胞中进行westernblot和qRT-PCR实验，结果发现与对照细胞相比，EGFRvIII组成型激活突变明显上调TRIM59蛋白和mRNA表达水平（图3B、C）。我们用EGF刺激过表达EGFR的U87细胞后，加入EGFR酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib处理，结果发现与未刺激组相比，
上海交通大学博士学位论文28EGF刺激明显上调TRIM59蛋白表达，而Erlotinib阻断EGFR激活，抑制了TRIM59蛋白表达上调（图3D）。我们用实验室已构建成功的EGFRvIII-KD（激酶失活突变体）高表达U87/EGFRvIII-KD细胞系进行westernblot实验，结果发现与U87/EGFRvIII细胞相比，EGFRvIII-KD突变下调TRIM59蛋白表达（图3E）。上述实验结果表明EGFR/EGFRvIII上调TRIM59蛋白和mRNA水平，并且依赖EGFR/EGFRvIII酪氨酸激酶活性。图3.EGFR激活上调TRIM59蛋白和mRNA水平.A.在增殖型和间质型胶质母细胞瘤中TRIM59mRNA表达水平明显高于前神经元型。B.在U87和LN229细胞中过表达EGFRvIII对TRIM59蛋白表达的影响。P:亲本细胞，vIII：LN229或U87细胞过表达EGFRvIII。箭代表EGFR，箭头代表EGFRvIII。C.qRT-PCR分析EGFRvIII对TRIM59mRNA表达影响。P:亲本细胞，vIII：LN229或U87细胞过表达EGFRvIII。D.在过表达EGFR的U87细胞中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib抑制EGFR磷酸化和EGFR激活上调TRIM59蛋白表达。箭代表EGFR。E.Westernblot分析EGFRvIII激酶失活突变对TRIM59表达的影响。P:亲本细胞，vIII：U87细胞过表达EGFRvIII。箭代
本文编号：3352004
【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：122 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
TRIM59在胶质母细胞瘤中的表达量显著高于在其他组织中的表达量
上海交通大学博士学位论文27为了进一步证实上述结果，我们对GEO数据库（GDS1816）胶质母细胞瘤临床样本进行生存分析同样发现TRIM59高表达胶质母细胞瘤患者预后差（图2B）。图2.Kaplan-Meier法分析TRIM59表达与胶质母细胞瘤患者预后相关性。A.生存分析TRIM59高表达与低表达患者预后。B.生存分析GDS1816数据集TRIM59高表达与低表达患者预后。Figure2.Kaplan-MeieranalysisoftherelationshipglioblastomapatientsprognosiswithdifferentTRIM59expression.A.Kaplan–MeieranalysisofpatientswithhighTRIM59protein-expressingGBMversuslowTRIM59protein-expressingtumors.B.Kaplan–MeieranalysisofpatientswithhighTRIM59mRNA-expressingGBMversuslowTRIM59mRNA-expressingtumors.ExpressiondataofTRIM59mRNAweredownloadedfromtheGDS1816dataset.3.3EGFR激活上调TRIM59蛋白和mRNA水平为了证明TRIM59与EGFR的关系，我们首先对GEO数据库（GDS1816）进行分析，发现TRIM59在增殖型和间质型胶质母细胞瘤中高表达，而这两种亚型胶质母细胞瘤高表达EGFR，这提示EGFR与TRIM59表达存在正相关性（图3A）。为了进一步证实上述结果，我们首先在LN229和U87细胞中过表达EGFR组成型激活突变体EGFRvIII构建EGFR组成型激活稳定细胞系。然后，在LN229、LN229/EGFRvIII细胞和U87、U87/EGFRvIII细胞中进行westernblot和qRT-PCR实验，结果发现与对照细胞相比，EGFRvIII组成型激活突变明显上调TRIM59蛋白和mRNA表达水平（图3B、C）。我们用EGF刺激过表达EGFR的U87细胞后，加入EGFR酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib处理，结果发现与未刺激组相比，
上海交通大学博士学位论文28EGF刺激明显上调TRIM59蛋白表达，而Erlotinib阻断EGFR激活，抑制了TRIM59蛋白表达上调（图3D）。我们用实验室已构建成功的EGFRvIII-KD（激酶失活突变体）高表达U87/EGFRvIII-KD细胞系进行westernblot实验，结果发现与U87/EGFRvIII细胞相比，EGFRvIII-KD突变下调TRIM59蛋白表达（图3E）。上述实验结果表明EGFR/EGFRvIII上调TRIM59蛋白和mRNA水平，并且依赖EGFR/EGFRvIII酪氨酸激酶活性。图3.EGFR激活上调TRIM59蛋白和mRNA水平.A.在增殖型和间质型胶质母细胞瘤中TRIM59mRNA表达水平明显高于前神经元型。B.在U87和LN229细胞中过表达EGFRvIII对TRIM59蛋白表达的影响。P:亲本细胞，vIII：LN229或U87细胞过表达EGFRvIII。箭代表EGFR，箭头代表EGFRvIII。C.qRT-PCR分析EGFRvIII对TRIM59mRNA表达影响。P:亲本细胞，vIII：LN229或U87细胞过表达EGFRvIII。D.在过表达EGFR的U87细胞中，EGFR酪氨酸激酶抑制剂Erlotinib抑制EGFR磷酸化和EGFR激活上调TRIM59蛋白表达。箭代表EGFR。E.Westernblot分析EGFRvIII激酶失活突变对TRIM59表达的影响。P:亲本细胞，vIII：U87细胞过表达EGFRvIII。箭代
本文编号：3352004
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