犬小孢子菌丝氨酸水解酶FSH1的功能及亚细胞定位研究
发布时间：2021-09-15 08:48
背景头癣是头皮及头发的浅部真菌感染,主要通过直接或间接接触患者或患病的动物传染。头癣一度受到控制,但由于近年来人们生活方式的改变,饲养宠物的流行,抗生素的滥用、皮质类固醇激素及免疫抑制剂的使用使得头癣的发病率逐年增加。目前国内外流行病学显示头癣的主要致病菌为犬小孢子菌。头癣好发于学龄前儿童,感染初期为无症状,可通过公用物品如枕头、梳子等传染,因而易出现扩散传播等问题,且预后因头皮化脓感染易形成瘢痕,或因发根毛囊破坏而导致永久性秃发,严重危害患儿的身心健康。目前头癣病因尚不清楚,且无相应的防预措施。因此研究头癣的致病因子,寻找有效的疫苗预防头癣的发生意义重大。大量相关数据显示头癣的发病与犬小孢子菌分泌的蛋白酶有关,包括角蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、酯酶、神经酰胺酶等,其中角蛋白酶的致病性比较明确。前期课题组根据头癣好发于儿童这一临床现象,设计出以成人头皮组织、儿童头皮组织及儿童光滑皮肤为不同诱导底物,比较犬小孢子菌产生的差异基因,从而寻找头癣的致病因子,其中筛选出基因片段之一为FSH1基因。通过实时定量PCR技术得出 FSH1基因在儿童头皮组织培养基中较光滑皮肤组织培养基中呈高度上调表达...
【文章来源】：大连医科大学辽宁省
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【图文】：
图２犬小孢子菌ＩＴＳ区ＰＣＲ?
大连医科大学博士学位论文??ｂｐ?Ｍ标准野生?ｂｐ?Ｍ标准野生??■?■??２０００＾＾＾＾＾＾！?２０００?■??７５０?７５０??５００?５００??１００??图２犬小孢子菌ＩＴＳ区ＰＣＲ?图３犬小孢子菌ＮＴＳ区ＰＣＲ??扩增产物（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００）?扩增产物（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００）??１．２犬小孢子菌野生株及标准株ＮＴＳ鉴定??以提取的犬小孢子菌总ＤＮＡ为模板，利用真菌鉴定通用引物ＩＧＳＬ与ＩＧＳＲ??对犬小孢子菌野生株及标准株的ＮＴＳ区序列进行扩增，扩增产物的琼脂凝胶电泳??检测结果见图３。由图３可以看出，犬小孢子菌标准株及野生株ＮＴＳ区ＰＣＲ扩增??后的带型一致。??２．犬小孢子菌ＦＳＨ１基因全长ｃＤＮＡ的克隆及序列分析??２．１犬小孢子菌总ＲＮＡ提取??提取犬小孢子菌标准株的总ＲＮＡ，用紫外分光光度计测得的ＯＤ２６０与ＯＤ２８０??的比值，约为１．６，表明ＲＮＡ的纯度较好。ＲＮＡ电泳结果２８Ｓ与１８Ｓ条带的亮度比值??为２：１，５Ｓ的亮度较弱（如图４所示），表明所提取的总ＲＮＡ完整．降解少。??２．２?３’?ＲＡＣＥ和Ｙ?ＲＡＣＥ扩增产物的电泳检测??根据测序结果，设计ＲＡＣＥ反应的特异引物，对获得的３’ＲＡＣＥ和５’ＲＡＣＥ序列??进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图５和６所示，ＦＳＨ１基因的３’ＲＡＣＥ和５’ＲＡＣＥ??ＰＣＲ序列长度分别约为７３０?ｂｐ和４５０?ｂｐ。??３９??
大连医科大学博士学位论文??２．３?ＦＳＨ１基因３’ＲＡＣＥ和５’ＲＡＣＥ扩增产物测序与全长序列验证??３’ＲＡＣＥ和５’ＲＡＣＥ扩增产物经过纯化、克垄测序，得到３’ＲＡＣＥ和５’ＲＡＣＥ??序列长度分别为４６６?ｂｐ和１９６?ｂｐ，加上已知ＦＳＨ１的基因片段，总长９４５?ｂｐ。通过??ＲＡＣＥ验证，获得ＦＳＨ１基因全长ｃＤＮＡ序列如图７所示，总长度为约８２０ｂｐ，可以证??明５?’ＲＡＣＥ和３?’ＲＡＣＥ产物来源于一条ｍＲＮＡ链且包含ＣＤＳ大多数序列。??Ｍ?１?２?３?４?Ｍ?１?２??＾?７５０??２５０?５００??２５０??１００圍??图４犬小孢子菌总ＲＮＡ鉴定图?图５?３’端第１轮ＰＣＲ扩增产物??（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００；?１－４：总ＲＮＡ）?（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００；?１：?３’端ＰＣＲ??产物；２：阴性对照）??２０００１??２００〇ｌ?Ｉ．??７５０?５００?Ｉ??５００?２５０?Ｉ??２５０?１００??１００??图６?５’端第１轮ＰＣＲ扩增产物?图７?ＲＡＣＥ序列验证的全长ＰＣＲ扩增??（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００；?１：?５’端ＰＣＲ产物（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００；?１：全??产物；２：阴性对照）?长ＰＣＲ产物；２：阴性对照）??４０??
【参考文献】：
期刊论文
[1]犬小孢子菌丝氨酸水解酶FSH1全长cDNA的克隆及序列分析[J]. 张芙蓉,徐宇,刘洋,杨国玲. 中国皮肤性病学杂志. 2017(01)
[2]头癣发病机制的研究进展[J]. 张芙蓉,杨国玲. 中国真菌学杂志. 2016(04)
[3]PQ-LRP基因沉默对犬小孢子菌生长及毒力的影响[J]. 张芳芳,张渊,栾莉,王华,黄鑫琳,刘金鹏,赵晓宣,杨国玲. 中国皮肤性病学杂志. 2015(04)
[4]RNA干扰技术对犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究[J]. 陈昕宜,杨国玲,刘建雯,刘金鹏,张芳芳,赵晓宣. 中华皮肤科杂志. 2014 (08)
[5]不同蛋白培养基对红色毛癣菌生长形态的影响[J]. 胡婵,朱红梅,谭宏月,李平,宋维芳,顾军,温海. 中国真菌学杂志. 2014(03)
[6]农杆菌介导的基因敲除技术在丝状真菌基因功能研究中的应用[J]. 李彩红,李志芳,冯自力,赵丽红,师勇强,王玲飞,刘义杰,朱荷琴. 棉花学报. 2013(03)
[7]儿童头皮与包皮组织诱导前后犬小孢子菌FSH1的表达[J]. 祝逸平,张振颖,庞娟,杨国玲. 中华皮肤科杂志. 2011 (06)
[8]我国大陆近年儿童头癣流行情况的回顾分析[J]. 李彩霞,刘维达. 中国真菌学杂志. 2011(02)
[9]儿童头皮及光滑皮肤组织对体外培养犬小孢子菌PQ-LRP表达水平的影响[J]. 张振颖,祝逸平,杨国玲. 中国皮肤性病学杂志. 2011(02)
[10]犬小孢子菌在光滑皮肤和头皮组织诱导条件下差异表达基因分析[J]. 张渊,张振颖,杨国玲,金礼吉. 中国皮肤性病学杂志. 2009(12)
博士论文
[1]皮肤癣菌比较基因组分析及中国头癣60年变迁调查[D]. 占萍.北京协和医学院 2015
[2]组氨酸激酶DRK1在申克孢子丝菌双相转换及致病性形成中的作用及黄芪抗小鼠孢子丝菌感染机制的初探[D]. 侯彬彬.大连医科大学 2013
[3]红色毛癣菌感染豚鼠模型的构建[D]. 陈先进.中国协和医科大学 2008
硕士论文
[1]PQ-LRP基因沉默对犬小孢子菌生长及毒力的影响及手术治疗皮肤淋巴细胞浸润症1例[D]. 张芳芳.大连医科大学 2015
[2]RNA干扰技术对犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究及面部线状红斑狼疮1例[D]. 陈昕宜.大连医科大学 2014
[3]犬小孢子菌生物学性状及基因分型研究[D]. 钱靖.兰州大学 2008
本文编号：3395773
【文章来源】：大连医科大学辽宁省
【文章页数】：112 页
【学位级别】：博士
【图文】：
图２犬小孢子菌ＩＴＳ区ＰＣＲ?
大连医科大学博士学位论文??ｂｐ?Ｍ标准野生?ｂｐ?Ｍ标准野生??■?■??２０００＾＾＾＾＾＾！?２０００?■??７５０?７５０??５００?５００??１００??图２犬小孢子菌ＩＴＳ区ＰＣＲ?图３犬小孢子菌ＮＴＳ区ＰＣＲ??扩增产物（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００）?扩增产物（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００）??１．２犬小孢子菌野生株及标准株ＮＴＳ鉴定??以提取的犬小孢子菌总ＤＮＡ为模板，利用真菌鉴定通用引物ＩＧＳＬ与ＩＧＳＲ??对犬小孢子菌野生株及标准株的ＮＴＳ区序列进行扩增，扩增产物的琼脂凝胶电泳??检测结果见图３。由图３可以看出，犬小孢子菌标准株及野生株ＮＴＳ区ＰＣＲ扩增??后的带型一致。??２．犬小孢子菌ＦＳＨ１基因全长ｃＤＮＡ的克隆及序列分析??２．１犬小孢子菌总ＲＮＡ提取??提取犬小孢子菌标准株的总ＲＮＡ，用紫外分光光度计测得的ＯＤ２６０与ＯＤ２８０??的比值，约为１．６，表明ＲＮＡ的纯度较好。ＲＮＡ电泳结果２８Ｓ与１８Ｓ条带的亮度比值??为２：１，５Ｓ的亮度较弱（如图４所示），表明所提取的总ＲＮＡ完整．降解少。??２．２?３’?ＲＡＣＥ和Ｙ?ＲＡＣＥ扩增产物的电泳检测??根据测序结果，设计ＲＡＣＥ反应的特异引物，对获得的３’ＲＡＣＥ和５’ＲＡＣＥ序列??进行琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图５和６所示，ＦＳＨ１基因的３’ＲＡＣＥ和５’ＲＡＣＥ??ＰＣＲ序列长度分别约为７３０?ｂｐ和４５０?ｂｐ。??３９??
大连医科大学博士学位论文??２．３?ＦＳＨ１基因３’ＲＡＣＥ和５’ＲＡＣＥ扩增产物测序与全长序列验证??３’ＲＡＣＥ和５’ＲＡＣＥ扩增产物经过纯化、克垄测序，得到３’ＲＡＣＥ和５’ＲＡＣＥ??序列长度分别为４６６?ｂｐ和１９６?ｂｐ，加上已知ＦＳＨ１的基因片段，总长９４５?ｂｐ。通过??ＲＡＣＥ验证，获得ＦＳＨ１基因全长ｃＤＮＡ序列如图７所示，总长度为约８２０ｂｐ，可以证??明５?’ＲＡＣＥ和３?’ＲＡＣＥ产物来源于一条ｍＲＮＡ链且包含ＣＤＳ大多数序列。??Ｍ?１?２?３?４?Ｍ?１?２??＾?７５０??２５０?５００??２５０??１００圍??图４犬小孢子菌总ＲＮＡ鉴定图?图５?３’端第１轮ＰＣＲ扩增产物??（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００；?１－４：总ＲＮＡ）?（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００；?１：?３’端ＰＣＲ??产物；２：阴性对照）??２０００１??２００〇ｌ?Ｉ．??７５０?５００?Ｉ??５００?２５０?Ｉ??２５０?１００??１００??图６?５’端第１轮ＰＣＲ扩增产物?图７?ＲＡＣＥ序列验证的全长ＰＣＲ扩增??（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００；?１：?５’端ＰＣＲ产物（Ｍ：标准参照物ＤＬ２０００；?１：全??产物；２：阴性对照）?长ＰＣＲ产物；２：阴性对照）??４０??
【参考文献】：
期刊论文
[1]犬小孢子菌丝氨酸水解酶FSH1全长cDNA的克隆及序列分析[J]. 张芙蓉,徐宇,刘洋,杨国玲. 中国皮肤性病学杂志. 2017(01)
[2]头癣发病机制的研究进展[J]. 张芙蓉,杨国玲. 中国真菌学杂志. 2016(04)
[3]PQ-LRP基因沉默对犬小孢子菌生长及毒力的影响[J]. 张芳芳,张渊,栾莉,王华,黄鑫琳,刘金鹏,赵晓宣,杨国玲. 中国皮肤性病学杂志. 2015(04)
[4]RNA干扰技术对犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究[J]. 陈昕宜,杨国玲,刘建雯,刘金鹏,张芳芳,赵晓宣. 中华皮肤科杂志. 2014 (08)
[5]不同蛋白培养基对红色毛癣菌生长形态的影响[J]. 胡婵,朱红梅,谭宏月,李平,宋维芳,顾军,温海. 中国真菌学杂志. 2014(03)
[6]农杆菌介导的基因敲除技术在丝状真菌基因功能研究中的应用[J]. 李彩红,李志芳,冯自力,赵丽红,师勇强,王玲飞,刘义杰,朱荷琴. 棉花学报. 2013(03)
[7]儿童头皮与包皮组织诱导前后犬小孢子菌FSH1的表达[J]. 祝逸平,张振颖,庞娟,杨国玲. 中华皮肤科杂志. 2011 (06)
[8]我国大陆近年儿童头癣流行情况的回顾分析[J]. 李彩霞,刘维达. 中国真菌学杂志. 2011(02)
[9]儿童头皮及光滑皮肤组织对体外培养犬小孢子菌PQ-LRP表达水平的影响[J]. 张振颖,祝逸平,杨国玲. 中国皮肤性病学杂志. 2011(02)
[10]犬小孢子菌在光滑皮肤和头皮组织诱导条件下差异表达基因分析[J]. 张渊,张振颖,杨国玲,金礼吉. 中国皮肤性病学杂志. 2009(12)
博士论文
[1]皮肤癣菌比较基因组分析及中国头癣60年变迁调查[D]. 占萍.北京协和医学院 2015
[2]组氨酸激酶DRK1在申克孢子丝菌双相转换及致病性形成中的作用及黄芪抗小鼠孢子丝菌感染机制的初探[D]. 侯彬彬.大连医科大学 2013
[3]红色毛癣菌感染豚鼠模型的构建[D]. 陈先进.中国协和医科大学 2008
硕士论文
[1]PQ-LRP基因沉默对犬小孢子菌生长及毒力的影响及手术治疗皮肤淋巴细胞浸润症1例[D]. 张芳芳.大连医科大学 2015
[2]RNA干扰技术对犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究及面部线状红斑狼疮1例[D]. 陈昕宜.大连医科大学 2014
[3]犬小孢子菌生物学性状及基因分型研究[D]. 钱靖.兰州大学 2008
本文编号：3395773
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