整合素-Hippo/YAP信号通路在软骨细胞代谢中的机制及理筋手法对其影响的实验研究
发布时间：2021-10-07 18:24
膝关节骨性关节炎（Knee Osteoarthritis,KOA）是多因素所导致的中老年人常见病和多发病,严重影响中老年人的身体健康和生活质量。软骨细胞退变是KOA发病的基础,而力学因素在软骨细胞退变中的作用机制一直以来都是研究的热点。本研究在力学刺激干预后软骨细胞差异表达蛋白质组学研究研究的基础上,进一步研究与力学刺激密切相关的整合素、Hippo/YAP信号通路变化,以及理筋手法干预后上述信号通路变化的规律,以期明确中医传统手法治疗KOA的作用机理。第一部分周期性压应力下膝骨关节炎软骨细胞差异表达蛋白质组学研究目的:应用蛋白组学技术观察周期性压力干预下KOA软骨细胞蛋白质差异表达变化。方法:将二周龄雄性SD大鼠,随机分为正常组、模型组和压力组,每组4只。正常组在常规的培养环境下,应用常规的压力进行培养;模型组在常规压力条件下,在培养基中加入TNF-α试剂模拟OA炎症环境培养;压力组在培养基中应用TNF-α刺激软骨细胞模拟OA炎症环境下,应用Flexcell-5000细胞牵张拉伸应力加载系统予以172k Pa、2Hz的周期性压应力,时间为60 min/d,连续干预3天。应用液相色谱-质...
【文章来源】：上海中医药大学上海市
【文章页数】：134 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
实验流程示例图
Ｃ扛?0min，将标本振摇60次，于3h后应用200目细胞筛1200rpm，然后离心10min，将离心后的细胞用含20％FBS的DMEM培养基在细胞培养瓶中进行接种，放入5％CO2，在37℃环境下培养箱中培养，6h后观察细胞贴壁情况，次日将标本细胞应用PBS清洗数次，然后更换新的含抗培养基，密切观察细胞融合度，当细胞融合度达到90％以后，更换培养基；次日上午应用PBS清洗，加入0.25％胰蛋白酶1mL覆盖细胞，再将培养瓶置于培养箱内消化5min，最后加入3mL培养基终止消化；500rpm，5min离心后，沉淀细胞用完全培养基重悬，再按比例进行传代。图1-2大鼠膝关节软骨细胞取材
上海中医药大学博士学位论文101.5.2大鼠膝关节软骨细胞鉴定分别应用甲苯胺蓝染色法和Ⅱ型胶原免疫组化染色法对大鼠膝关节软骨细胞进行鉴定。（1）甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞表型软骨细胞爬片48h，应用配置的PBS溶液进行冲洗，然后再用4%的多聚甲醛进行固定，固定时间为30min，再用1%的甲苯胺蓝进行染色30min，最后用无水乙醇进行冲洗，将涂片置于空气中干燥，中性树脂封片，镜下观察。（2）Ⅱ型胶原免疫细胞化染色法鉴定软骨细胞表型制作细胞爬片，常规培养48h，严格按照免疫组化试剂盒说明书进行操作。具体步骤如下：①倾去培养液，应用冰PBS漂洗3次，每次3min，然后加入4%多聚甲醛1ml，在室温固定15min。②应用PBS溶液反复漂洗标本3次，每次3min，然后滴加3％H202，室温下孵育10min。③应用PBS溶液反复漂洗标本3次，每次3min，滴加穿膜液0.5ml(0.1％timton+0.1MGlycine)冰上孵育30min。④应用PBS溶液反复漂洗标本3次，加入BSA0.5ml，室温下封闭1h。⑤在封口膜上滴加的兔抗大鼠II型胶原多克隆抗体50ul（1：150稀释），然后放在湿盒中4℃过夜。⑥PBS反复漂洗，加入二抗工作液，37℃孵育20min；PBS反复漂洗，加1滴SABC试剂，37℃孵育20min，PBS反复漂洗。最后DAB显色苏木素轻度复染，脱水，干燥，封片，电子显微镜下观察。图1-3软骨细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化染色如图1-3所示：显微镜下观察，软骨细胞甲苯胺蓝染色其细胞内表呈现紫红
本文编号：3422547
【文章来源】：上海中医药大学上海市
【文章页数】：134 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
实验流程示例图
Ｃ扛?0min，将标本振摇60次，于3h后应用200目细胞筛1200rpm，然后离心10min，将离心后的细胞用含20％FBS的DMEM培养基在细胞培养瓶中进行接种，放入5％CO2，在37℃环境下培养箱中培养，6h后观察细胞贴壁情况，次日将标本细胞应用PBS清洗数次，然后更换新的含抗培养基，密切观察细胞融合度，当细胞融合度达到90％以后，更换培养基；次日上午应用PBS清洗，加入0.25％胰蛋白酶1mL覆盖细胞，再将培养瓶置于培养箱内消化5min，最后加入3mL培养基终止消化；500rpm，5min离心后，沉淀细胞用完全培养基重悬，再按比例进行传代。图1-2大鼠膝关节软骨细胞取材
上海中医药大学博士学位论文101.5.2大鼠膝关节软骨细胞鉴定分别应用甲苯胺蓝染色法和Ⅱ型胶原免疫组化染色法对大鼠膝关节软骨细胞进行鉴定。（1）甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞表型软骨细胞爬片48h，应用配置的PBS溶液进行冲洗，然后再用4%的多聚甲醛进行固定，固定时间为30min，再用1%的甲苯胺蓝进行染色30min，最后用无水乙醇进行冲洗，将涂片置于空气中干燥，中性树脂封片，镜下观察。（2）Ⅱ型胶原免疫细胞化染色法鉴定软骨细胞表型制作细胞爬片，常规培养48h，严格按照免疫组化试剂盒说明书进行操作。具体步骤如下：①倾去培养液，应用冰PBS漂洗3次，每次3min，然后加入4%多聚甲醛1ml，在室温固定15min。②应用PBS溶液反复漂洗标本3次，每次3min，然后滴加3％H202，室温下孵育10min。③应用PBS溶液反复漂洗标本3次，每次3min，滴加穿膜液0.5ml(0.1％timton+0.1MGlycine)冰上孵育30min。④应用PBS溶液反复漂洗标本3次，加入BSA0.5ml，室温下封闭1h。⑤在封口膜上滴加的兔抗大鼠II型胶原多克隆抗体50ul（1：150稀释），然后放在湿盒中4℃过夜。⑥PBS反复漂洗，加入二抗工作液，37℃孵育20min；PBS反复漂洗，加1滴SABC试剂，37℃孵育20min，PBS反复漂洗。最后DAB显色苏木素轻度复染，脱水，干燥，封片，电子显微镜下观察。图1-3软骨细胞甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原免疫细胞化染色如图1-3所示：显微镜下观察，软骨细胞甲苯胺蓝染色其细胞内表呈现紫红
本文编号：3422547
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