基于链置换探针的肿瘤早期检测新方法研究

发布时间：2021-10-17 15:47

　　分子影像和体外分子诊断是最有望实现肿瘤早期微、无创检测的两大技术。与经典影像不同,分子影像例如荧光分子成像,能够探查肿瘤早期形成过程中细胞和分子水平的异常,即在尚无解剖学改变之前就能检查出异常,这对肿瘤早期检测有重要价值。然而分子影像学技术的发展还处于临床前实验阶段,大多分子探针的靶向性或特异性还有待提高。另一方面,循环肿瘤DNA（ctDNA）因含有丰富的肿瘤相关遗传信息或突变信息成为体外分子诊断研究热点之一。借助PCR技术和DNA杂交技术,一些ctDNA检测试剂已经用于临床肿瘤疾病的辅助诊断。由于ctDNA在标本中的含量非常少,并且丰度较低的肿瘤突变基因中往往伴随着大量的野生型基因,这对ctDNA检测技术的灵敏度有很高的要求。现有的ctDNA检测技术的灵敏度有限,检测相应的低丰度突变（<1%）ctDNA的肿瘤标本时会出现漏检的情况。无论是分子影像还是体外分子诊断都需要发展高特异性、高灵敏度的分子探针。本研究聚焦于分子影像和体外分子诊断领域在临床应用中共同存在的问题并以此为出发点,探究提高DNA链置换探针特异性的方法及其用于改善分子影像技术和分子诊断技术性能的可行性,具体研究内容... 

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：132 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

Au-TDNNs的结构及其检测活细胞内miRNA-21的工作原理

31TDNNs.3.2设计双链检测探针在检测探针的设计过程中，根据miRNA-21的过表达水平和生物学意义，本实验选择miRNA-21作为检测靶标[165,188]。在达到近似热力学平衡（ΔG0≈0）的条件下，期望探针Exp可与靶标自发杂交[148]。为了比较ExP的特异性，实验设计了普通检测探针（OrP）作为ExP的对照探针。OrP2与靶标杂交产物的吉布斯自由能变小于OrP2与OrP1杂交的吉布斯自由能变（表2.4）。标准吉布斯自由能可以用ΔG0=-RTln（Keq）计算，其中T表示凯氏温度，R表示气体常数，Keq表示平衡常数。在7nt立足点（Toehold）的条件下，链置换反应的速率常数为1×106M-1s-1[146]。本文使用专业软件UNAfold（http://mfold.rna.albany.edu/）模拟双链核酸的热力学参数，表2.4总结了实验中双链核酸的热力学参数。图2.1为ExP和OrP在检测miRNA-21过程中识别单碱基突变靶标和野生型靶标的工作原理。本实验新设计了TDN的寡核苷酸序列，以避免与检测探针发生非特异性杂交，所有寡核苷酸序列均在表2.2中提供。图2.1ExP（A）和OrP（B）用于识别单碱基突变靶标和野生型靶标的工作原理。Tehold介导的链置换探针（例如ExP1P2）由补体链ExP2和保护链ExP1杂交组成，它们可以与靶标反应产生ExP1和TExP2。

33图2.2（A，B）分别使用ExP和OrP检测中间，远端，近端单碱基突变靶标和野生型miRNA-21靶标的荧光动力学曲线。（C）在检测单碱基突变靶标和野生型miRNA-21靶标时，ExP和OrP的荧光强度增量。（D）ExP和OrP的相应识别因子（DF）。（E）紫外-可见光吸收光谱表征Au-TDNNs在SSC，PBS和DMEM（10％FBS）中的稳定性。（F）Au-TDNN逐步组装产物的Zeta电位分析。RFI：相对荧光强度。DF=ΔFtarget/ΔFtargetanalogue（ΔF=F-F0，F0：背景荧光）。*P＜0.001。Fig.2.2(A,B)Fluorescencekineticcurvesofmutationbaseinthemiddle,distalorproximalsiteofthetargetandtargetdetectionbyExPandOrP,respectively.(C)Relativefluorescence


本文编号：3442012