KLF4和miR27b在血管疾病中的功能和分子机制的研究

发布时间：2017-05-04 19:02

  本文关键词：KLF4和miR27b在血管疾病中的功能和分子机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一章：KLF4在HRMECs中的功能和分子机制的研究研究目的血管再生是发育过程中已有血管生成新血管的生理过程,在胚胎发育过程中具有重要的作用。人们广泛地研究了血管再生在很多疾病中的治疗效果,通过抑制血管生成或者促新血管生成药物来控制血管再生。血管内皮生长因子(VEGF)是一种血管增生因子。通过激活VEGF信号通路,可有效促进血管再生。在临床上,VEGF抗体或者VEGF受体(VEGFR)激酶抑制剂哌加他尼钠、兰尼单抗及贝伐单抗等已被批准应用,用来治疗癌症、年龄相关性黄斑变性及糖尿病性视网膜病变。虽然在治疗过程中出现了一定的疗效,但一些副作用依然频发,如：慢性皮肤型红斑狼疮及眼内中枢神经系统(CNS)淋巴瘤等。因此,还需要对VEGF信号通路在这些疾病中的作用规律进行进一步的研究。转录因子KrUppel样因子4(KLF4),是能够将成年型细胞重编成诱导多能干细胞(iPSCs)的四大因子之一；在重新编码过程中,KLF4通过抑制上皮向间充质细胞的转化(EMT)而发挥着作用。KLF4作用下的EMT与肿瘤转移存在一定的关联,对此人们已在几种人类癌症中进行广泛的研究。通过瞄准VEGF通路,EMT可促进血管再生。在维持内皮祖细胞表型的过程中,KLF4是关键的调节因子；通过激活AKT通路,白血病抑制因子和血管内皮生长因子能够上调KLF4。最近一项研究发现,KLF4通过调节miR-15a来抑制细胞周期蛋白D1,削弱内皮细胞中的管状形成。然而另外一项调查结果则显示,通过调节notch信号通路KLF4能够促进内皮细胞中的血管再生。在基因表达谱上,人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)各自具有不同的特性。转录因子Kruppel-like factor 4 (KLF4)对人类细胞的细胞增殖、迁移和分化起到了调节的作用,并且是诱导干细胞重组的四个因素之一,然而,它在眼部新生血管性疾病中的作用还没有探明。本实验的目的是探讨其在HRMECs血管生成中的作用和潜在的分子机制。实验方法细胞培养：HRMECs在Cell Systems (Kirkland, WA)购买,Medium131作为基础培养基,其中加入了10%的FBS,1%的微血管生长因子添加剂,10 μg/ml庆大霉素,100 U/ml青霉素,100 μg/ml链霉素。在37℃5%的二氧化碳培养箱中培养。所有的实验都在细胞培养五代之内进行。慢病毒载体的构建：本课题中,KLF4过表达慢病毒载体的构建参照分子克隆的标准方法完成。KLF4shR1和KLF4shR2在GE Dharmacon (Lafayette, CO)购买。shRNA作用KLF4的目标序列为5’GCTCCATTACCA AGA GCTCAT (KLF4shR1)和5’GCCAGAATTGGACCCG GTGTA (KLF4shR2),对照pLK01-scrambe(#1864)在Addgene (Cambridge, MA)购买。HEK293FT细胞包装慢病毒。纯化后的慢病毒转染HRMECs,3 μg/ml嘌呤霉素筛选转染48小时后的细胞。MTT分析：96孔板每孔接种5000个细胞,含1%FBS的培养液饥饿培养12小时后VEGF (50 ng/ml)处理。此后,96孔板中,每个孔加入10μl MTT反应物,培养箱内培养4小时后加入100μl的detergent来终止反应,测量570 nm的OD值来反映细胞的增殖情况。细胞迁移实验：使用购买于BD Science(Franklin Lakes, NJ)公司的细胞迁移室进行细胞迁移实验。细胞迁移室置入24孔板内。300 μLM131中包含2×104个细胞,加入到每个迁移室的上部。终浓度为50 ng/ml的VEGF作为诱导因子添加到每个小室的底部。培养基和未迁移的细胞被隔离在小室的上层,内置迁移室的24孔板培养在5%二氧化碳培养箱内12小时。在薄膜底部迁移的细胞用甲醇固定,结晶紫染色,倒置显微镜拍摄图片。迁移细胞数从三个不同的区域统计,计算迁移率。血管形成分析：基底膜基质TM(Biosciences)在4℃过夜解冻,在每个96孔板中加入60μl。聚合反应的条件是37℃,30 min。无VEGF处理的细胞在M131培养基中重悬,调整细胞数量后接种在凝胶的上部,细胞培养箱培养8小时。每孔中选择3个视野计算管状结构的分支点和分枝数,分析作图。荧光素酶报告基因分析：1.5 kb和0.2 kb Vegf启动子报告载体和带有KLF4 Tet-on的慢病毒载体共同转染HRMECs, PSV40 Rellina质粒作为内参质粒。1 ug/ml DOX诱导KLF4表达。firefly荧光素酶和renilla荧光素酶底物在转染后24小时后分别测量,计算firefly荧光素酶和renilla荧光素酶表达的比例。免疫荧光染色：为检验HRMECs中VEGF和KLF4的表达,KLF4表达细胞和对照组细胞用4% PFA固定10分钟,含0.1%Tween20的PBS洗3次,封闭液(5%的正常山羊血清,3%牛血清白蛋白,包含0.1% Triton-X 100的PBS)孵育1小时。VEGF和KLF4的抗体稀释液孵育过夜,PBST冲洗3次×5分钟后,室温下,二抗稀释液孵育1小时。DAPI进行细胞核复染色,尼康倒置荧光显微镜采集图像。Western Blot:HRMECs总蛋白的提取,取等量的蛋白(30 μg/lane)进行SDS-PAGE凝胶电泳,然后将其转移到硝酸纤维素膜上,封闭膜,一抗二抗孵育膜,在sigma公司(St. Louis, MO)购买GAPDH的一抗,在Cell Signaling购买P-ERK1/2, P-AKT, p-VEGFR2的一抗。结果慢病毒载体对Klf4基因进行沉默和过表达。我们构建了Klf4基因DOX-responsive启动子启动表达的慢病毒载体。为诱导Klf4基因在HRMECs中过表达,在细胞培养基中加入了终浓度为1 μg/ml的DOX, western blot检测KLF4的表达,结果表明Klf4基因表达与对照组相比蛋白水平提高了6倍,有显著性差异(t=-5.543,P=0.005)。使用pLKO1 shRNA慢病毒载体沉默Klf4基因的表达。Western blot检测基因敲低的效果,与对照组相比,Klf4基因在HRMECs中表达分别降低了86%和91%,都具有显著性意义(F=594.822,P0.001)。为检验KLF4在HRMECs增殖方面的作用,在无或者有50 ng/ml的VEGF处理下,对Klf4基因过表达和敲低的细胞进行MTT分析。Klf4过表达的细胞在24小时、48小时、72小时和96小时,相比对照组细胞增殖显著(t=-6.082,t=-5.206, t=-2.979, t=-2.997, t=-3.498, t=-8.461, t=-2.887, t=-7.334, P=0.004, P=0.006, P=0.041, P=0.040, P=0.025, P=0.001, P=0.045, P=0.002),而KLF4shRNA1和KLF4shRNA2的细胞与对照组细胞相比,在48小时、72小时和96小时,细胞的增殖显著下降。50 ng/ml VEGF作为诱导因子,对过表达和shRNA敲低Klf4的HRMECs分别进行transwell迁移实验。与对照组细胞相比,过表达Klf4的HRMECs显著增多了细胞的迁移数量(t=-12.211,P0.001)。不论有没有VEGF诱导,不同KLF4shRNA沉默的HRMECs显著降低了细胞的迁移能力(F=35.931,F=185.110,P0.001)。为验证KLF4如何影响VEGF诱导的血管生成,我们对Klf4敲低和过表达两种细胞的微管形成能力进行分析。结果表明：过表达Klf4促进微管的形成,沉默Klf4抑制微管的形成。50 ng/ml VEGF处理过表达和沉默Klf4基因的HRMECs 5或15分钟后,检测其下游受体VEGFR2及P-ERK1/2、P-AKT两个细胞信号通路蛋白。发现在HRMECs中过表达Klf4增强VEGF对AKT和ERK1/2信号通路的激活,与空白对照组相比有显著性意义,两种shRNA沉默Klf4使得VEGF诱导的信号通路蛋白表达降低,与空白对照组相比有显著性意义。分析发现Vegf转录起始位点上游具有KLF4的结合位点(CACCC)序列,假设KLF4与]7egf启动子结合并激活Vegf的表达。为验证这个假说,用荧光素酶报告基因载体分析了带有Vegf启动子结构1.5 kb和0.2 kb侧翼序列的转基因HRMECs,0.2 kb Vegf启动子序列中没有KLF4的结合位点,1.5 kb启动子序列区域内有三个潜在的结合位点,在带有1.5 kb启动子序列的HRMECs中过表达KLF4导致荧光素酶表达量显著上升(t=-12.486,P0.001),但是在带有0.2 kb Vegf启动子序列的转基因HRMECs中,与对照组细胞相比没有显著的差异。这一结果表明,KLF4结合Vegf的启动子区域。为进一步确定KLF4对Vegf的调控,DOX诱导KLF4在不同时间点表达,然后western blot检验HRMECs中相应时间点VEGF的表达,VEGF的表达在DOX诱导3、6和12h时显著增加。结论KLF4结合Vegf启动子区域,上调Vegf表达。KLF4增强HRMECs中VEGF介导的信号通路,激活VEGFR2和下游ERK1/2、AKT信号通路。KLF4促进HRMECs的增殖、迁移和微管形成。第二章：miR-27b在MVSMCs中的功能和分子机制的研究研究目的近年来,miRNA是生物学研究的热点,生物体内许多生理、病理过程都与miRNA直接相关。miRNA在进化过程中具有高度保守的特点,是一种内源性非编码RNA,在转录后水平抑制基因的表达,参与生物的代谢,并且在代谢中发挥重要作用。miRNA在促进血管平滑肌细胞(VSMCs)表型变化的过程中,发挥着重要的功能,但对其发挥功能的内在分子机制,依然不是十分明确。编码miR-27b的基因位于第9染色体,在人类和小鼠中,niR-27b基因序列保守,在肿瘤中的研究表明,miR-27b对胃癌细胞的生长和迁移具有抑制作用,但对乳腺癌和宫颈癌细胞的增殖有促进作用。在正常的生理情况下,miR-27b调节肌肉脂肪细胞的分化,在肝脂肪细胞的迁移中发挥重要作用,在血管生成过程中,miR-27b促进内皮细胞的增殖和迁移,促进血管的新生。本实验的目的是探讨miR-27b在MVSMCs中的功能和发挥作用的潜在分子机制。实验方法细胞培养、MTT分析、荧光素酶报告基因分析、transwell迁移实验、慢病毒包装、免疫荧光染色、western blot的实验方法参见第一章。结果为研究PDGF和miR-27b在MVSMCs中的关系,在PDGF浓度为20 ng/ml的条件下,选取PDGF处理的不同时间点,测定miR-27b的表达水平。随着PDGF处理时间的延长,miR-27b的表达水平升高,处理6小时,miR-27b的升高与对照组相比具有显著差异(t=-5.706,P=0.005),处理24小时,miR-27b 的表达量是对照组的4.67倍(t=-7.038,P=0.002)。为进一步明确二者之间的关系,用不同浓度的PDGF处理MVSMCs, miR-27b表达的升高与PDGF的处理浓度正相关,20 ng/ml的PDGF处理浓度对提高miR-27b的表达效果最强,是对照组的5.1倍(t=-28.086,P=0.001)。体外建立miR-27b过表达和敲低的慢病毒载体,通过qPCR检测细胞中miR-27b的表达水平,发现与对照组相比,过表达组的miR-27b表达升高了55.67%,敲低组的niR-27b表达降低了93.33%。通过绘制MVSMCs的生长曲线,研究过表达和敲低miR-27b对细胞增殖的调控,PDGF处理的niR-27b过表达组MVSMCs的增殖能力最强,miR-27b敲低的MVSMCs增殖能力最低,同时用激光共聚焦扫描显微镜来获取MVSMCs免疫荧光染色的图片,比较PCNA的表达,发现过表达miR-27b的MVSMCs对照组细胞敲低miR-27b的MVSMCs,用细胞划线和transwell的实验方法来研究miR-27b对MVSMCs迁移的影响,在niR-27b过表达组,细胞迁移能力为PDGF处理的过表达miR-27b的MVSMCsPDGF处理的对照组细胞无PDGF处理的miR-27b过表达的MVSMCs无PDGF处理的对照组细胞,在miR-27b敲低组,细胞迁移能力的结果为PDGF处理的对照组细胞无PDGF处理组的对照组细胞PDGF处理的miR-27b敲低的MVSMCs无PDGF处理组的miR-27b敲低的MVSMCs。细胞免疫荧光的实验方法研究miR-27b在MVSMCs中对凋亡的影响,发现过表达miR-27b对MVSMCs的凋亡具有抑制作用,而敲低miR-27b促进了MVSMCs的凋亡。我们继续对miR-27b发挥作用的分子机制进行研究,通过western blot在蛋白水平上检测,发现miR-27b调控SMA的表达。在大鼠和小鼠VSMCs中,过表达miR-27b的VSMCs的SMA表达量显著低于对照组细胞,而敲低miR-27b的VSMCs的SMA的表达量显著高于对照组细胞(F=139.001,P=0.001);CNN1和SM22的表达水平在三种细胞间并无显著差异；对SMA进行细胞免疫荧光实验,SMA在敲低miR-27b的MVSMCs中表达量最高,高于对照组细胞,而在过表达miR-27b的MVSMCs中,SMA的表达量最低,低于对照组细胞。Luciferase assay的实验结果为,过表达niR-27b的质粒同表达SMA3'UTR的野生型质粒共同转染MVSMCs时,萤光素酶的表达量降低,在转染了野生型报告基因载体和敲低miR-27b质粒的MVSMCs中,萤光素酶的表达量升高,与对照组相比具有显著性差异(t=3.525,P=0.024)。对MVSMCs的AKT和ERK1/2信号通路的检测发现,没有PDGF处理和有PDGF处理的时候,miR-27b过表达组的P-AKT和P-ERK1/2表达水平都显著高于对照组(t=-19.148, t=-4.535, t=-4.481, t=-10.230, t=-11.348, t=-7.265, P0.001, P=0.011, P=0.011, P=0.001, P0.001, P=0.002);而没有PDGF处理的时候,miR-27b敲低组的P-AKT和P-ERK1/2表达水平都显著低于对照组(t=15.702, t=38.089, P=0.004, P0.001), PDGF处理后,P-AKT和P-ERK1/2的表达也升高,敲低miR-27b组显著低于对照组(t=34.496, t=18.077, t=20.074, t=36.867, P=0.001, P0.001, P0.001, P=0.001)。结论miR-27b在MVSMCs是一个控制细胞增殖和迁移的因子,被PDGF所调控,过表达miR-27b对MVSMCs的增殖和迁移有促进的作用,敲低miR-27b对MVSMCs的增殖和迁移有抑制的作用,过表达miR-27b对MVSMCs的凋亡有抑制的作用,敲低miR-27b对MVSMCs的凋亡有促进的作用。对于其作用机制的研究表明,过表达miR-27b下调MVSMCs标记性基因sma的表达,敲低miR-27b对其表达有上调的作用,但是miR-27b对MVSMCs另外的两个标记性基因sm22和cnn1的表达没有影响。对其进一步的研究发现,VSMCs的标记基因sma是miR-27b直接的靶基因。对信号通路的研究发现,miR-27b提高了PDGF影响的细胞信号通路ERK1/2和AKT的激活。实验结果表明,miR-27b是一个调控VSMCs表型的开关,对于术后新生血管狭窄和动脉粥样硬化疾病, miR-27b是一个潜在的作用位点。
【关键词】：Kr(u|")ppel样因子4 血管内皮生长因子 人视网膜微血管内皮细胞 miR-27b 血小板衍生生长因子 小鼠血管平滑肌细胞
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543
【目录】：

• 摘要3-11
• ABSTRACT11-22
• 第一章 KLF4在HRMECs中的功能和分子机制的研究22-90
• 第一节 前言22-33
• 1.1.1 KLF4转录因子22-26
• 1.1.2 VEGF26-31
• 1.1.3 眼部病理性新生血管与治疗策略31-32
• 1.1.4 本研究的目的与意义32-33
• 第二节 材料与方法33-47
• 1.2.1 材料33-39
• 1.2.2 方法39-46
• 1.2.3 统计学分析46-47
• 第三节 结果47-66
• 1.3.1 使用慢病毒载体建立过表达和敲低Klf4的HRMECs细胞系47-49
• 1.3.2 KLF4在转录水平上激活Vegf的表达49-53
• 1.3.3 KLF4增强VEGF介导的信号通路53-57
• 1.3.4 KLF4促进VEGF诱导的HRMECs增殖57-60
• 1.3.5 KLF4促进VEGF诱导的HRMECs迁移60-63
• 1.3.6 KLF4促进VEGF诱导HRMECs形成微管63-66
• 第四节 讨论66-73
• 1.4.1 shRNA技术和慢病毒载体技术实现HRMECs中Klf4的体外敲低和过表达66-67
• 1.4.2 KLF4与视网膜新生血管形成67-68
• 1.4.3 眼部新生血管相关疾病治疗的新策略68-69
• 1.4.4 KLF4通过启动子结合参与Vegf的调控69-71
• 1.4.6 KLF4作用于VEGF的下游信号通路71-73
• 参考文献73-90
• 第二章 miR-27b在MVSMCs中的功能和分子机制的研究90-140
• 第一节 前言90-97
• 2.1.1 miRNA的产生与调控90-91
• 2.1.2 参与血管代谢的miRNA91-94
• 2.1.3 miR-27的研究进展94-95
• 2.1.4 PDGF在血管生成中的作用95-96
• 2.1.5 miR-27b在血管生成中的作用与本实验的目的意义96-97
• 第二节 材料与方法97-102
• 2.2.1 材料97
• 2.2.2 方法97-101
• 2.2.3统计学分析101-102
• 第三节 结果102-125
• 2.3.1 PDGF调控miR-27b在MVSMCs中的表达102-104
• 2.3.2 过表达miR-27b和敲低miR-27b的MVSMCs细胞系的建立104-105
• 2.3.3 过表达和敲低miR-27b对MVSMCs增殖的影响105-109
• 2.3.4 过表达和敲低miR-27b对MVSMCs迁移的影响109-113
• 2.3.5 过表达和敲低miR-27b对MVSMCs凋亡的影响113-116
• 2.3.6 miR-27b调控MVSMCs中sma基因的表达116-122
• 2.3.7 过表达和敲低miR-27b对MVSMCs的AKT和ERK1/2信号通路的影响122-125
• 第四节 讨论125-130
• 2.4.1 PDGF在代谢中的作用及对miR-27b的调控125-126
• 2.4.2 miR-27b的靶基因及影响的信号通路126-128
• 2.4.3 miR-27b影响MVSMCs的增殖、迁移和凋亡128-130
• 参考文献130-140
• 第三章 展望与结论140-143
• 第一节 研究展望140-141
• 3.1.1 第一章研究展望140
• 3.1.2 第二章研究展望140-141
• 第二节 全文结论141-143
• 3.2.1 第一章结论141
• 3.2.2 第二章结论141-143
• 成果143-144
• 致谢144-146
• 统计学审稿证明146

  本文关键词：KLF4和miR27b在血管疾病中的功能和分子机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：345601