Inpp5f在糖尿病心肌病变中的作用及其机制研究

发布时间：2017-05-04 21:11

  本文关键词：Inpp5f在糖尿病心肌病变中的作用及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：糖尿病严重威胁人类健康。近些年,糖尿病的患病率大幅度上升,并且在未来的25年里将成为世界上引起致残和致死的主要的因素之一。糖尿病心肌病表现为心室功能障碍,与冠状动脉和高血压无关,是糖尿病患者发病率和死亡率的首要原因,但是糖尿病心肌病的具体发病机制还不清楚。胰岛素缺乏的1型糖尿病和胰岛素抵抗的2型糖尿病与代谢性应激(主要是高血压和高血脂)一起是公认的糖尿病心肌病发病的危险因素。这些危险因素共同作用可降低葡萄糖摄取,促进脂肪酸的摄取和氧化。这种代谢方式的转变在心肌病的形成中发挥着重要的作用,但具体的分子机制并不十分清楚。胰岛素/PI3K/Akt信号通路在整个分子事件中发挥重要的作用。因此,研究胰岛素/PI3K/Akt信号通路在糖尿病中是如何调整信号转录方式以及如何发生异常显得至关重要。Inpp5f(Inositol polyphosphate-5-phosphatase F)编码全长为1132aa的蛋白,该蛋白含有一个352aa的SAC磷酸酶结构域。Inpp5f是一种肌醇磷酸酶,主要在心、脑、肾表达。近期研究发现Inpp5f是Akt信号的负调控因子,但是该分子在糖尿病心脏中的表达和功能还不清楚。因此,本课题旨在探讨Inpp5f在糖尿病心肌病中的作用以及具体的分子机制。【目的】1)在糖尿病动物模型中查看Inpp5f的表达变化,分析糖尿病相关因素(胰岛素、高糖和高脂)与Inpp5f表达的相关性;2)心脏病理和超声心动图评价动物心脏功能,分析Inpp5f表达与糖尿病小鼠心肌病变的相关性;3)分析糖尿病心肌病变中Inpp5f表达变化的原因:代谢应激(胰岛素、高糖和高脂)对Inpp5f表达的影响;4)探讨胰岛素、高糖和高脂等代谢应激影响Inpp5f表达的深层次分子机制;5)探讨Inpp5f的表达异常是否影响心肌细胞的胰岛素信号和生理功能。【方法和结果】1)通过腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法建立1型糖尿病模型,通过高脂饮食(HFD)诱导的方法建立2型糖尿病模型;q RT-PCR和Westernblot结果显示糖尿病小鼠心脏组织中Inpp5f的表达升高;统计学结果表明胰岛素,血糖,胆固醇和甘油三酯的水平与Inpp5f的表达具有相关性。2)超声和组织学结果显示糖尿病小鼠的心脏发生结构和功能改变,包括心脏增大,射血分数值(EF)降低,左室等容舒张时间(IVRT)延长;统计学分析结果表明Inpp5f的表达与EF值呈负相关,与IVRT呈正相关。3)在H9C2心肌细胞中,使用胰岛素、高糖或游离脂肪酸刺激,q RT-PCR和Westernblot检测Inpp5f的表达,结果发现胰岛素,高糖和脂肪酸均能增加H9C2中Inpp5f的表达。4)Westernblot结果显示胰岛素使心肌细胞Sp1的表达升高;而高糖和游离脂肪酸处理使心肌细胞NF-κB信号活化;q RT-PCR和Westernblot结果表明Sp1抑制剂能降低胰岛素对Inpp5f的表达促进作用,而NF-κB的抑制剂能降低高糖和游离脂肪酸引起的Inpp5f表达升高。5)双荧光素酶报告系统结果显示胰岛素,高糖和游离脂肪酸使Inpp5f的启动子活性升高,而Sp1和NF-κB的抑制剂降低了代谢应激引起的Inpp5f启动子活性升高;免疫共沉淀(Ch IP)结果表明转录因子Sp1和NF-κB能够和Inpp5f的启动子结合;6)Westernblot结果显示腺病毒介导的Inpp5f的过表达能降低心肌细胞Akt磷酸化水平,而干涉Inpp5f的表达则导致Akt磷酸化水平升高;高糖和游离脂肪酸能降低心肌细胞内Akt的磷酸化水平,但干涉Inpp5f的表达能逆转上述变化;利用流式细胞术探讨细胞葡萄糖摄取的实验中发现,干涉Inpp5f能促进心肌细胞对葡萄糖的摄取。【结论】我们发现一个新的磷酸酶Inpp5f在糖尿病心肌病变中扮演了重要角色。Inpp5f在糖尿病心肌病变的失代偿期表达升高,其表达量与心脏功能有显著的相关性;在分析Inpp5f表达升高原因时发现,胰岛素、高糖和高脂因素均能导致其表达增加,进一步研究发现,胰岛素通过活化Sp1转录因子,而高糖和高脂则通过活化NF-κB信号转录调节Inpp5f的表达;Inpp5f能抑制心肌细胞Akt的磷酸化以及心肌细胞对葡萄糖的摄取。综合这些结果,我们提出了一个糖尿病心脏损伤过程中的分子调节环路,即正常情况下,胰岛素通过活化PI3K/Akt促进心肌细胞葡萄糖的摄取,与此同时通过转录机制诱导负性调控分子Inpp5f的表达,控制PI3K/Akt的活性,获得信号调节的平衡。糖尿病病变早期,胰岛素减少或抵抗导致PI3K/Akt的活性降低,此时,负性调节因子Inpp5f的表达同样降低,心肌细胞处于代偿期。随着糖尿病不断进展,高糖/高脂因素积累后诱发持续的微炎症状态,NF-κB信号活化。NF-κB信号通过转录机制促进Inpp5f的表达,表达升高的Inpp5f进一步抑制PI3K/Akt,因而加重心脏损伤。我们提出了一个新的胰岛素、高糖、高脂因素影响Inpp5f/PI3K/Akt信号的调节环路,阐明了该环路调节在糖尿病心肌病变中的作用,为糖尿病心肌病变的诊治提供了新的思路。
【关键词】：糖尿病 心肌病 Inpp5f PI3K/Akt 反馈环路
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R587.2
【目录】：

• 缩略语表6-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-17
• 前言17-18
• 文献回顾18-36
• 第一部分：糖尿病小鼠模型的建立及Inpp5f在心脏组织中的表达36-48
• 1． 材料36-37
• 1.1 实验材料36
• 1.2 主要试剂36-37
• 1.3 主要仪器37
• 2．方法37-42
• 2.1 STZ和HFD糖尿病小鼠模型的建立37
• 2.2 Inpp5f在糖尿病小鼠心脏组织中的表达37-41
• 2.3 糖尿病小鼠模型血清学检测41-42
• 3.结果42-46
• 3.1 糖尿病小鼠模型的血清学指标检测：42-44
• 3.2 糖尿病小鼠心脏组织中Inpp5f的表达44-45
• 3.3 糖尿病小鼠血清学指标与心脏Inpp5f表达的相关性分析45-46
• 4.讨论46-48
• 第二部分：Inpp5f表达与糖尿病小鼠心脏功能的相关性分析48-55
• 1．材料48-49
• 1.1 实验材料48
• 1.2 主要试剂48
• 1.3 主要仪器48-49
• 2. 方法49-50
• 2.1 糖尿病小鼠心脏形态和功能检测49-50
• 3. 结果50-53
• 3.1 糖尿病小鼠模型心脏形态观察及心脏功能检测50-51
• 3.2 心脏Inpp5f表达水平及其与心脏功能的相关性51-53
• 4.讨论53-55
• 第三部分：Inpp5f在糖尿病小鼠心脏中表达升高原因分析55-59
• 1．材料55-56
• 1.1 实验材料55
• 1.2 主要试剂55-56
• 1.3 主要仪器56
• 2.方法56-57
• 2.1 细胞培养和药物处理56-57
• 3.结果57-58
• 4.讨论58-59
• 第四部分：Inpp5f表达的深层分子机制探讨59-70
• 1．材料59-60
• 1.1 实验材料59
• 1.2 主要试剂59-60
• 1.3 主要仪器60
• 2.方法60-64
• 2.1 载体构建60-61
• 2.2 质粒转染61
• 2.3 Inpp5f启动子双荧光素酶报告系统61
• 2.4 胞浆蛋白和核蛋白提取61-62
• 2.5 染色质免疫共沉淀（Ch IP）62-64
• 3.结果64-68
• 3.1 Inpp5f种属保守性分析和启动子序列分析64-65
• 3.2 胰岛素，高糖和FFA通过不同转录因子促进Inpp5f的表达65-67
• 3.3 Sp1和NF-κB直接转录调节Inpp5f表达67-68
• 4.讨论68-70
• 第五部分：Inpp5f对心肌细胞Akt活性和葡萄糖转运的影响70-76
• 1．材料70-71
• 1.1 实验材料70
• 1.2 主要试剂70-71
• 1.3 主要仪器71
• 2.方法71-73
• 2.1 si RNA转染71-72
• 2.2 流式细胞术检测 2-NBDG的摄取72
• 2.3 腺病毒载体的构建和病毒包装72
• 2.4 Akt活性检测72-73
• 3．结果73-75
• 3.1 糖尿病心脏组织中Inpp5f表达与Akt活性的相关性分析73
• 3.2 心肌细胞中Inpp5f对Akt的影响73-74
• 3.3 Inpp5f对心肌细胞葡萄糖转运的影响74-75
• 4.讨论75-76
• 小结76-78
• 参考文献78-89
• 个人简介和研究成果89-91
• 致谢91-92

  本文关键词：Inpp5f在糖尿病心肌病变中的作用及其机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：345809