DNA电化学生物传感器检测肺癌患者表皮生长因子受体基因突变状态的实验研究
本文关键词：DNA电化学生物传感器检测肺癌患者表皮生长因子受体基因突变状态的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：表皮生长因子受体(EGFR)是细胞通路中传递细胞信号的一种重要物质。EGFR基因突变状态是靶向药物小分子酪氨酸激酶抑制剂用于非小细胞肺癌的治疗疗效的重要预测指标,国内外各权威指南均推荐需对EGFR突变状态进行检测,但目前无标准检测方法。DNA电化学传感器具有灵敏度高,特异性好,而且简便、经济、易行等特点而备受关注。本课题组在应用电化学传感器检测基因方面具有一定的研究基础,前期实验成功构建“基于蛋白质控制组装界面的安培型DNA电化学传感器”,具有良好的重现性和灵敏度。本研究应用前期构建的安培型电化学传感器,采用三明治结构的i-t法,检测肺癌患者EGFR基因突变状态,并对其外显子19的6种热点缺失类型(del1-del6)进行区分。通过利用DNA杂交特点设计不同碱基序列,提高特异性,采用引入核酸酶形成杂交酶切循环和免疫学中的链霉亲和素-生物素复合物(SABC)等方法提高灵敏度,建立非小细胞肺癌患者EGFR检测新技术,实现对临床肺癌组织实际样品PCR产物的检测,本研究最终为DNA电化学传感器检测疾病诊治相关基因并广泛应用于临床奠定实验基础。本文主要研究工作如下:(1)在第一部分中,为了提高DNA电化学传感器的检测特异性,我们利用DNA在不同相系中杂交效率不同的特点,设计3种不同序列的DNA:C、R、C/R。3种DNA之间的主要区别是缺失序列在目标链中分布的位置不同,从而使得非互补序列之间的杂交分别发生在电极表面、杂交液中以及电极表面和杂交液中各一半。实验结果表明应用C型DNA(非互补杂交发生在电极表面的DNA序列),具有最佳的杂交特异性,并用其构建具有高特异性的DNA电化学传感器。同时,我们对人工合成双链样品的测定进行研究,比较了高温变性和λ-exo消化两种制备单链DNA的方法对电化学检测的影响。结果表明,λ-exo消化产物可得到接近人工合成单链的电流值,且无复性等弊端,与三明治检测系统不存在相互作用,可作为获得单链的方法与dna电化学传感器三明治检测系统联用。随后,应用所构建的dna电化学传感器对临床肺癌组织的pcr产物进行检测。实验设计6种不同的引物并优选pcr结果最好的引物进行后续实验。通过λ-exo对pcr产物的处理,成功获得目标ssdna,应用dna电化学传感器采用i-t法检测,根据所得电流信号可区分野生型与缺失型egfr。(2)在第一部分的基础上,第二部分对egfr外显子19的6种常见缺失类型进行区分。第一部分实验结果证实,非互补序列之间的杂交发生在接近电极表面的传感器特异性更高,本部分为达到各种缺失类型间的最大区分度,通过设计不同探针,对dna探针中非互补序列的位置进行优化,研究在电极表面的非均相杂交环境中,非互补杂交发生在捕获探针上的不同位置对杂交特异性的影响,结果显示非互补序列分布在捕获探针中段时,单碱基错配的del1和del2之间可显示最佳区分度,此时杂交特异性最好。基于此结果,结合egfr常见的6种突变类型进行捕获探针设计,并根据检测电流结果进行适当分组,简化工作量,实现了快速区分egfr基因外显子19的突变类型。同时运用以上的方法对实际样品的pcr产物进行检测,所得结果与测序结果相符,证明了本检测方法的准确性,成功用于实际样品区分egfr外显子19的6种热点缺失类型。(3)第三部分将前两部分应用的“基于蛋白质控制组装界面的安培型dna电化学传感器”与核酸外切酶辅助形成的杂交-酶切循环信号放大系统相结合,构建一种在液相的均相介质中进行酶切的具有放大效应的复合体系。通过目标链与辅助链杂交形成双链,触发核苷酸酶对双链中的辅助链的识别及剪切作用,形成杂交-酶切循环,使少量目标链通过多次重复利用而达到放大检测信号的目的。为了选择最适外切酶,对exo-iii和λ-exo进行比较,根据结果选择λ-exo参与反应,同时对杂交酶切的反应时间,酶切浓度等条件进行优化。并进一步考察了生物素在双链中的位置对检测信号的影响,发现缩短生物素与电极表面距离,可增加检测响应电流信号,并依此优选生物素在三明治构型传感器中的位置。本部分所构建的传感器较之单独bsa控制组装的体系,可显著降低检测限至0.01nm,线性范围是2.0×10-11-4.0×10-10m,并具有良好的特异性,可区分野生型与缺失型egfr。(4)第四部分在第三部分的基础上,将酶切对象改变为信号探针,使信号探针具有可被酶切及信号报告的双重作用,简化杂交酶切循环体系,减少参与反应的DNA的种类数,使检测对象能够更直接地反映目标序列的存在情况。同时,为了扩大信号探针的响应信号,提高灵敏度,我们引入了免疫学中SABC法,通过链霉亲和素标记的辣根过氧化酶(SA-H)与生物素标记的辣根过氧化酶(B-H)形成复合物,并将复合物与电极表面的生物素结合,可增加辣根过氧化物酶(HRP)结合到电极表面上的量,提高电流信号。通过两种信号放大方法,可显著提高灵敏度,检测限达到1 pM,线性范围2.0×10-12-3.0×10-11M。将本方法用于实际样品PCR产物的检测,检测结果与测序结果一致,本方法可有效区分临床实际样品中的野生型与缺失型EGFR。
【关键词】：DNA电化学传感器 时间电流曲线法 表皮生长因子受体 聚合酶链式反应 λ核酸外切酶 杂交-酶切循环 链霉亲和素生物素复合物法
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R734.2
【目录】：
- 英文缩写词表5-7
- 中文摘要7-10
- 英文摘要10-14
- 前言14-32
- 1. EGFR 突变概述14-15
- 2. EGFR 基因突变检测的临床意义15
- 3. 常用EGFR基因突变检测方法15-16
- 4. DNA 电化学生物传感器检测方法16-17
- 5. 提高 DNA 电化学生物传感器特异性17-18
- 6. 提高 DNA 电化学生物传感器灵敏度18-20
- 7. 应用电化学传感器检测临床实际样品20-23
- 参考文献23-32
- 第一部分 基于DNA杂交相系特点设计EGFR基因电化学传感器32-60
- 1.1 仪器与试剂35-39
- 1.2 实验方法39-45
- 1.3 结果和讨论45-50
- 1.4 实际样品的检测50-53
- 1.5 小结53-55
- 参考文献55-60
- 第二部分DNA探针中非互补序列的位置优化60-86
- 2.1 仪器与试剂62-66
- 2.2 实验方法66-70
- 2.3 结果与讨论70-78
- 2.4 实际样品的检测78-82
- 2.5 小结82-83
- 参考文献83-86
- 第三部分 核酸外切酶辅助目标链循环信号放大86-108
- 3.1 仪器与试剂89-91
- 3.2 实验方法91-94
- 3.3 结果与讨论94-104
- 3.4 小结104-105
- 参考文献105-108
- 第四部分 酶辅助循环与生物素-链霉亲和素酶复合物双重信号放大108-132
- 4.1 仪器与试剂111-114
- 4.2 实验方法114-117
- 4.3 结果与讨论117-127
- 4.4 实际样品的检测127-129
- 4.5 小结129-130
- 参考文献130-132
- 结论132-134
- 致谢134-135
- 综述135-149
- 参考文献146-149
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