炎症小体下游新型效应分子的鉴定和功能研究
发布时间：2021-11-09 06:50
炎症小体是天然免疫系统的重要组成部分,在抵抗病原入侵和维持机体稳态等方面都发挥了不可或缺的作用。炎症小体主要是天然免疫细胞内的多蛋白复合体,由位于细胞质的模式识别受体、接头蛋白ASC和天冬氨酸蛋白水解酶caspase-1组成。在受到特定刺激后,受体蛋白、ASC和caspase-1聚集并引起caspase-1互相切割而获得活性,进而切割其下游底物gasdermin D（GSDMD）、白细胞介素（Interleukin,IL）-1β和IL-18。被切割的GSDMD会导致细胞焦亡以及成熟的IL-1β和IL-18分泌。然而,除了IL-1β和IL-18之外,还有很多细胞内蛋白会在炎症小体激活之后通过非经典途径分泌。另外,随着研究的深入,人们也逐渐意识到炎症小体的很多功能并不能只通过熟知的IL-1β和IL-18这两个效应分子来解释。那么其它的效应分子是什么,它们有什么样的功能却不为所知。因此,我的博士论文工作以此为出发点,通过质谱分析小鼠巨噬细胞的蛋白质分泌组,鉴定到一组蛋白,其中以galectin-3为代表。我们发现它在炎症小体激活后会大量地分泌。Galectin-3的分泌对炎症小体的特异性没有...
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)上海市
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
LS-MS/MS鉴定分析炎症小体依赖的巨噬细胞蛋白质分泌组
第3章实验结果23件下（LPS+ATP）的分泌组。利用非标记的定量液相二级质谱分析，一共鉴定到733个蛋白，其中129个蛋白仅出现在WT的分泌组中，另有3个蛋白只出现在Nlrp3-/-的分泌组中。在两组中都出现的604个蛋白中，有78个蛋白在WT组中的丰度显著高于Nlrp3-/-组（WT/Nlrp3-/-≥2,P＜0.05）。此外，有6个蛋白在WT组中的丰度则显著低于Nlrp3-/-组（WT/Nlrp3-/-≤2,P＜0.05）（图3.1A）。通过基因功能注解（GeneOntology,GO）的细胞组分（CellularComponent,CC）分析发现这些蛋白都位于细胞内部（图3.1B），因而不同于通过经典分泌途径内质网-高尔基体组成性分泌的蛋白。3.1.22D-PAGE-MS分析炎症小体依赖的巨噬细胞分泌组由于不同的刺激会改变细胞的响应方式，因而也会影响细胞蛋白的分泌。另外，ATP单独刺激也会引起蛋白质的分泌。而且非标记LC-MS/MS仅能区别不同组之间蛋白质丰度的差异，却不能反映它们的绝对丰度，因此，我们利用2D-PAGE比较了只由LPS刺激的WT和Nlrp3+/R258W（NLRP3功能获得性突变，可由LPS激活）BMDM的分泌蛋白（图3.2A）。图3.22D-PAGE与MS偶联分析炎症小体依赖的巨噬细胞分泌蛋白图注：（A），2D-PAGE分析LPS刺激的WT和Nlrp3+/R258WBMDM的细胞培养上清，将图中数字标注的蛋白质斑点取出做质谱分析。（B），从（A）中取出的蛋白质斑点经质谱鉴定得到的蛋白质信息。因为LPS刺激可以激活Nlrp3+/R258WBMDM中的NLRP3炎症小体，却不能激活WTBMDM中的NLRP3炎症小体93，我们在2D-PAGE中发现了许多差异明显的蛋白斑点，将其中差异明显的蛋白斑点（图3.2A中由数字标记）取出做质谱鉴定，得到了如图2B所示的9个蛋白（图3.2B）。与非标记LC-MS/MS的
第3章实验结果24结果整合分析后，发现4个蛋白（图3.2B红色标记）在WT和Nlrp3+/R258W组间差别显著。3.2炎症小体调控Galectin-3的分泌3.2.1Galectin-3是潜在的炎症小体效应分子通过比较4个蛋白在WT和Nlrp3-/-组间的差别，galectin-3和PPIA的差异明显（分别为6.25倍和9.1倍），且显著（分别为P＜0.02和P＜0.01）(图3.3A-B)。根据文献报道，galectin-3和PPIA都能够分泌到细胞外，并且在不同的生理和病理条件下发挥着重要的作用。PPIA是免疫亲和蛋白家族的成员，广泛分布于各种细胞中97。能通过肽酰-脯氨酰顺反异构酶活性催化蛋白质顺反异构化，调节蛋白质折叠和运输97。胞外的PPIA也有多种功能，包括传递促炎信号、招募免疫细胞等，而目前报道的PPIA的主要作用在影响血管功能及参与如动脉粥样硬化等血管疾病的进展97。图3.3Galectin-3是潜在的炎症小体效应分子图注：（A），列表中的蛋白质在LC-MS/MS中的数据分析。（B），LC-MS/MS的火山图分析。Galectin-3属于凝集素家族。与其他半乳糖凝集素不同，galectin-3由氨基端的非凝集素结构域和羧基端的糖类识别结构域（carbohydraterecognitiondomain,CRD）组成98。Galectin-3主要通过它羧基端的CRD特异地识别β-galactosides99，而它的氨基端则有助于galectin-3形成同源多聚体。现有的文献报道显示，胞外的galectin-3参与免疫调节、肿瘤的进展、代谢、细胞-细胞以及细胞-基质间的粘附、软骨和骨基质重塑、器官纤维化、动脉粥样硬化和其它血管疾病98,100,101。同时血清中的galectin-3也逐渐成为一个新的疾病诊断和预后的标志物102。由于MartinKeller等人在UVB处理的人角质细胞分泌组中发现了galectin-3，可是它的分泌受炎症小体活性的影响并不大，而且他们并没有在THP-1中重复此发现
本文编号：3484836
【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院上海巴斯德研究所)上海市
【文章页数】：110 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
LS-MS/MS鉴定分析炎症小体依赖的巨噬细胞蛋白质分泌组
第3章实验结果23件下（LPS+ATP）的分泌组。利用非标记的定量液相二级质谱分析，一共鉴定到733个蛋白，其中129个蛋白仅出现在WT的分泌组中，另有3个蛋白只出现在Nlrp3-/-的分泌组中。在两组中都出现的604个蛋白中，有78个蛋白在WT组中的丰度显著高于Nlrp3-/-组（WT/Nlrp3-/-≥2,P＜0.05）。此外，有6个蛋白在WT组中的丰度则显著低于Nlrp3-/-组（WT/Nlrp3-/-≤2,P＜0.05）（图3.1A）。通过基因功能注解（GeneOntology,GO）的细胞组分（CellularComponent,CC）分析发现这些蛋白都位于细胞内部（图3.1B），因而不同于通过经典分泌途径内质网-高尔基体组成性分泌的蛋白。3.1.22D-PAGE-MS分析炎症小体依赖的巨噬细胞分泌组由于不同的刺激会改变细胞的响应方式，因而也会影响细胞蛋白的分泌。另外，ATP单独刺激也会引起蛋白质的分泌。而且非标记LC-MS/MS仅能区别不同组之间蛋白质丰度的差异，却不能反映它们的绝对丰度，因此，我们利用2D-PAGE比较了只由LPS刺激的WT和Nlrp3+/R258W（NLRP3功能获得性突变，可由LPS激活）BMDM的分泌蛋白（图3.2A）。图3.22D-PAGE与MS偶联分析炎症小体依赖的巨噬细胞分泌蛋白图注：（A），2D-PAGE分析LPS刺激的WT和Nlrp3+/R258WBMDM的细胞培养上清，将图中数字标注的蛋白质斑点取出做质谱分析。（B），从（A）中取出的蛋白质斑点经质谱鉴定得到的蛋白质信息。因为LPS刺激可以激活Nlrp3+/R258WBMDM中的NLRP3炎症小体，却不能激活WTBMDM中的NLRP3炎症小体93，我们在2D-PAGE中发现了许多差异明显的蛋白斑点，将其中差异明显的蛋白斑点（图3.2A中由数字标记）取出做质谱鉴定，得到了如图2B所示的9个蛋白（图3.2B）。与非标记LC-MS/MS的
第3章实验结果24结果整合分析后，发现4个蛋白（图3.2B红色标记）在WT和Nlrp3+/R258W组间差别显著。3.2炎症小体调控Galectin-3的分泌3.2.1Galectin-3是潜在的炎症小体效应分子通过比较4个蛋白在WT和Nlrp3-/-组间的差别，galectin-3和PPIA的差异明显（分别为6.25倍和9.1倍），且显著（分别为P＜0.02和P＜0.01）(图3.3A-B)。根据文献报道，galectin-3和PPIA都能够分泌到细胞外，并且在不同的生理和病理条件下发挥着重要的作用。PPIA是免疫亲和蛋白家族的成员，广泛分布于各种细胞中97。能通过肽酰-脯氨酰顺反异构酶活性催化蛋白质顺反异构化，调节蛋白质折叠和运输97。胞外的PPIA也有多种功能，包括传递促炎信号、招募免疫细胞等，而目前报道的PPIA的主要作用在影响血管功能及参与如动脉粥样硬化等血管疾病的进展97。图3.3Galectin-3是潜在的炎症小体效应分子图注：（A），列表中的蛋白质在LC-MS/MS中的数据分析。（B），LC-MS/MS的火山图分析。Galectin-3属于凝集素家族。与其他半乳糖凝集素不同，galectin-3由氨基端的非凝集素结构域和羧基端的糖类识别结构域（carbohydraterecognitiondomain,CRD）组成98。Galectin-3主要通过它羧基端的CRD特异地识别β-galactosides99，而它的氨基端则有助于galectin-3形成同源多聚体。现有的文献报道显示，胞外的galectin-3参与免疫调节、肿瘤的进展、代谢、细胞-细胞以及细胞-基质间的粘附、软骨和骨基质重塑、器官纤维化、动脉粥样硬化和其它血管疾病98,100,101。同时血清中的galectin-3也逐渐成为一个新的疾病诊断和预后的标志物102。由于MartinKeller等人在UVB处理的人角质细胞分泌组中发现了galectin-3，可是它的分泌受炎症小体活性的影响并不大，而且他们并没有在THP-1中重复此发现
本文编号：3484836
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