白血病外泌体分子工程与生物传感和RNA药物递送载体的构建
发布时间：2021-11-15 13:33
外泌体（exosomes）是几乎所有细胞都分泌的一种脂质纳米囊泡,存在于各种体液中。通过特定的形成机理,外泌体携带供体细胞中的成分释放到胞外,被认为是细胞排放垃圾和与外界交流的一种重要方式。研究表明,外泌体可以根据自己所携带的成分跟附近或远端的细胞发生作用,并使其在受体细胞中发挥不同的功能。而外泌体的不同功能主要是基于供体细胞根据自身状态调节所分泌外泌体成分和数量来实现。因此,作为细胞自身释放的一种天然纳米囊泡,由于其成分不仅能反应细胞自身状态,还能在体内运输功能活性分子,外泌体具有作为一种天然纳米药物运送载体及肿瘤诊疗标志物的潜力。虽然,外泌体作为肿瘤诊疗标志物及药物运送载体具有巨大潜力和优点,但其相关研究还不成熟。为此,探索外泌体在肿瘤诊疗中的作用是现在研究的重点。本文基于外泌体作为肿瘤诊断标志物及药物递送载体的潜力和优点,对外泌体在白血病诊疗中的应用进行了研究。研究工作主要分为以下几个部分:首先,通过对白血病细胞系来源外泌体的蛋白质组学分析发现,核仁素具有作为识别白血病相关外泌体标志物之一的潜力。其次,基于对外泌体上核仁素蛋白的识别,设计了一个检测白血病相关外泌体的双信号放大荧光...
【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：104 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
外泌体的生物起源分子机制[8]
通过慢病毒包装和浸染的方法,融合蛋白(Palm-EGFP-CIBN和CRY2-mCherry-MCP)和RNA(BFP-miR-21sponge-MS2)的基因序列可以被整合到293T细胞的基因组上,使其稳定表达蛋白和RNA。因此,我们通过病毒的包装方法首先收集了分别包装上述三种基因的慢病毒,图5-2a是293T细胞包装病毒后的荧光成像图。其中,转染上述三种质粒后的细胞都表达了相应的荧光蛋白,说明三个表达质粒成功转入到了细胞。随后,把收集的三种病毒同时对293T细胞进行侵染,如果病毒成功的把三个基因都整合到了细胞的基因组,293T细胞就会同时表达EGFP、mCherry和BFP三种荧光蛋白。通过流式细胞仪的荧光筛选,即可得到所需的稳转细胞系(工程化293T细胞)。然后,将分选得到的细胞放到含有10%FBS和双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中培养,待细胞贴壁后用酶标仪对其进行成像验证。如图5-2b所示,通过流式分选的细胞全部都有上述三种荧光的表达,表明我们成功筛选得到了所需的稳转细胞系。5.4.2 蓝光调控RNA在细胞膜上富集的验证
为了观察上述稳转细胞中表达的融合蛋白和RNA能否发挥功能,我们采用激光共聚焦显微镜对细胞中的蛋白和RNA进行了成像分析。如图5-3a所示,其是激光共聚焦显微镜对工程化293T细胞中Palm-EGFP-CIBN和CRY2-mCherry-MCP位置变化的分析结果。从图中可以看到,mCherry的红色荧光在488 nm蓝光刺激前是均匀分布在整个细胞质中的,EGFP表达的绿色荧光富集到了整个细胞质膜上。但488 nm蓝光刺激后,mCherry的红色荧光快速迁移到了细胞质膜上(大概不到1s),并与EGFP的绿色荧光重叠。此外,在488 nm的蓝光刺激20 min后,mCherry的红色荧光又由于CIBN和CYR2的可逆相互作用重新分布在了整个细胞质中。图5-3b是对细胞中RNA能否随着CRY2-mCherry-MCP蛋白富集到细胞质膜上的验证。为此,我们把Palm-CIBN、CRY2-mCherry-MCP和FAM-MS2共同转染到了293T细胞中。随后,通过激光共聚焦显微镜进行成像分析。结果表明,在488 nm蓝光刺激前的FAM和m Cherry会均匀的分布在整个细胞质中。但488 nm蓝光持续刺激细胞后,大量的绿色和红色荧光便迅速转移到了细胞质膜上。此外,为了证明上述结果的可靠性,我们还采用了没有Palm序列的EGFP-CIBN蛋白作为对照。如图5-4a所示,在没有Palm序列的时候,EGFP的绿色和m Cherry的红色荧光在488 nm蓝光激发前后都会随机分布在细胞质中,而不会迁移到质膜上。同时,在没有Palm序列时,转染的FAM-MS2适配体也不会通过488 nm蓝光刺激迁移到细胞质膜上(图5-4b、图5-4c)。因此,这些结果可以表明蓝光介导的CIBN-CYR2作用和MS2-MCP作用可以使细胞中的RNA富集到细胞质膜上。图5-4蓝光对细胞中蛋白定位的影响。(a)293T细胞瞬时转染EGFP-CIBN和CRY2-mCherry-MCP后的激光共聚焦显微镜成像;(b)293T细胞转染FAM-MS2后的激光共聚焦显微镜成像;(c)细胞转染CINB、CRY2-m Cherry-MCP和FAM-MS2后的激光共聚焦显微镜成像。在所有成像中,FAM和m Cherry都需在4 8 8 nm蓝光刺激前后分别成像。标尺:10μm
本文编号：3496879
【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：104 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
外泌体的生物起源分子机制[8]
通过慢病毒包装和浸染的方法,融合蛋白(Palm-EGFP-CIBN和CRY2-mCherry-MCP)和RNA(BFP-miR-21sponge-MS2)的基因序列可以被整合到293T细胞的基因组上,使其稳定表达蛋白和RNA。因此,我们通过病毒的包装方法首先收集了分别包装上述三种基因的慢病毒,图5-2a是293T细胞包装病毒后的荧光成像图。其中,转染上述三种质粒后的细胞都表达了相应的荧光蛋白,说明三个表达质粒成功转入到了细胞。随后,把收集的三种病毒同时对293T细胞进行侵染,如果病毒成功的把三个基因都整合到了细胞的基因组,293T细胞就会同时表达EGFP、mCherry和BFP三种荧光蛋白。通过流式细胞仪的荧光筛选,即可得到所需的稳转细胞系(工程化293T细胞)。然后,将分选得到的细胞放到含有10%FBS和双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基中培养,待细胞贴壁后用酶标仪对其进行成像验证。如图5-2b所示,通过流式分选的细胞全部都有上述三种荧光的表达,表明我们成功筛选得到了所需的稳转细胞系。5.4.2 蓝光调控RNA在细胞膜上富集的验证
为了观察上述稳转细胞中表达的融合蛋白和RNA能否发挥功能,我们采用激光共聚焦显微镜对细胞中的蛋白和RNA进行了成像分析。如图5-3a所示,其是激光共聚焦显微镜对工程化293T细胞中Palm-EGFP-CIBN和CRY2-mCherry-MCP位置变化的分析结果。从图中可以看到,mCherry的红色荧光在488 nm蓝光刺激前是均匀分布在整个细胞质中的,EGFP表达的绿色荧光富集到了整个细胞质膜上。但488 nm蓝光刺激后,mCherry的红色荧光快速迁移到了细胞质膜上(大概不到1s),并与EGFP的绿色荧光重叠。此外,在488 nm的蓝光刺激20 min后,mCherry的红色荧光又由于CIBN和CYR2的可逆相互作用重新分布在了整个细胞质中。图5-3b是对细胞中RNA能否随着CRY2-mCherry-MCP蛋白富集到细胞质膜上的验证。为此,我们把Palm-CIBN、CRY2-mCherry-MCP和FAM-MS2共同转染到了293T细胞中。随后,通过激光共聚焦显微镜进行成像分析。结果表明,在488 nm蓝光刺激前的FAM和m Cherry会均匀的分布在整个细胞质中。但488 nm蓝光持续刺激细胞后,大量的绿色和红色荧光便迅速转移到了细胞质膜上。此外,为了证明上述结果的可靠性,我们还采用了没有Palm序列的EGFP-CIBN蛋白作为对照。如图5-4a所示,在没有Palm序列的时候,EGFP的绿色和m Cherry的红色荧光在488 nm蓝光激发前后都会随机分布在细胞质中,而不会迁移到质膜上。同时,在没有Palm序列时,转染的FAM-MS2适配体也不会通过488 nm蓝光刺激迁移到细胞质膜上(图5-4b、图5-4c)。因此,这些结果可以表明蓝光介导的CIBN-CYR2作用和MS2-MCP作用可以使细胞中的RNA富集到细胞质膜上。图5-4蓝光对细胞中蛋白定位的影响。(a)293T细胞瞬时转染EGFP-CIBN和CRY2-mCherry-MCP后的激光共聚焦显微镜成像;(b)293T细胞转染FAM-MS2后的激光共聚焦显微镜成像;(c)细胞转染CINB、CRY2-m Cherry-MCP和FAM-MS2后的激光共聚焦显微镜成像。在所有成像中,FAM和m Cherry都需在4 8 8 nm蓝光刺激前后分别成像。标尺:10μm
本文编号：3496879
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