突变的组蛋白去乙酰化酶4抑制软骨细胞肥大促进软骨细胞增殖的作用及机制研究

发布时间：2021-12-12 13:34

　　目的:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是导致中老年人功能残疾、经济负担加重的主要疾病之一。近年来,OA发病率逐年增高,且发病年龄出现了逐步年轻化的趋势,但OA的临床治疗仍局限于对症治疗,如缓解关节疼痛、关节肿胀等症状,严重者只能行关节置换手术,尚无有效的软骨损伤修复方法。软骨组织工程是目前关节软骨损伤修复研究领域的重点之一,可以利用少量的软骨细胞经过体外培养、扩增后,附着在一定的支架材料上移植到体内形成新的有生命力的软骨组织,对软骨损伤进行修复。但研究发现在多次传代培养过程中,软骨细胞逐渐肥大并失去其表型,且增殖能力也会显著降低,不能产生正常的软骨基质,丧失形成软骨的能力。因此在体外扩增软骨细胞过程中有效抑制肥大分化,促进增殖是软骨组织工程亟待解决的关键问题之一。组蛋白去乙酰化酶4（HDAC4）是一种II类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）,主要分布在脑、肌肉和软骨组织中。研究表明HDAC4可通过抑制Runx-2（软骨细胞肥大分化的关键基因）的转录活性,抑制软骨细胞肥大分化,不仅在软骨细胞肥大和骨骼发育过程中起着中心调控作用,在OA发病过程中也发挥了重要作用。值得注意的是,我... 

【文章来源】：山西医科大学山西省

【文章页数】：72 页

【学位级别】：博士

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前言
第一部分 突变HDAC4Caspase-3降解位点及14-3-3结合位点可有效增加软骨细胞核内HDAC4含量
    1 材料与方法
        1.1 主要实验仪器设备
        1.2 实验试剂
        1.3 主要实验操作流程
    2 结果
        2.1 软骨细胞表型鉴定结果显示:离体培养的软骨细胞状态良好,未发生失分化现象
        2.2 腺病毒转染离体培养的人软骨细胞所需浓度选择及转染效率检测
        2.3 突变Caspase-3降解位点可有效减少HDAC4降解
        2.4 突变14-3-3结合位点可有效减少HDAC4与14-3-3蛋白之间的结合
        2.5 与野生型HDAC4组(WT-HDAC4)相比,突变组(M-HDAC4)细胞核内HDAC4含量显著增高
第二部分 突变的HDAC4可有效抑制软骨细胞肥大促进软骨细胞增殖
    1 材料与方法
        1.1 主要实验仪器设备
        1.2 实验试剂
        1.3 主要实验操作流程
    2 结果
        2.1 Real time-PCR结果显示:与WT-HDAC4组相比,M-HDAC4组软骨细胞肥大指标Runx-2,Type-Ⅹcollagen及MMP-13表达量均显著降低
        2.2 Western blot结果显示:与WT-HDAC4组相比,M-HDAC4组软骨细胞肥大指标Runx-2,TypeⅩcollagen及MMP-13蛋白水平显著降低
        2.3 Real time-PCR结果显示:与WT-HDAC4组相比,M-HDAC4组软骨细胞增殖指标TypeⅡ collagen,Aggrecan及 Sox-9 表达量均显著增高
        2.4 Western blot结果显示:与WT-HDAC4组相比,M-HDAC4组软骨细胞增殖指标TypeⅡ collagen,Aggrecan及 Sox-9 蛋白水平显著增高
        2.5 CCK-8 细胞增殖检测结果显示:与WT-HDAC4组相比,M-HDAC4组软骨细胞增殖能力显著增高
        2.6 与Control组比,WT-HDAC4及M-HDAC4组软骨细胞中PCNA蛋白含量均显著增高,且M-HDAC4组PCNA含量增高更为明显高
第三部分 HDAC4可能通过与增殖细胞核抗原(PCNA)结合促进软骨细胞增殖
    1 材料与方法
        1.1 主要实验仪器设备
        1.2 实验试剂
        1.3 主要实验操作流程
    2 结果
        2.1 HDAC4可与PCNA直接结合,且M-HDAC4结合能力较WT-HDAC4更强
        2.2 HDAC4与PCNA结合位点检测
    3 讨论
        3.1 HDAC4进入细胞核是其对靶蛋白发挥去乙酰化作用的必要前提
        3.2 HDAC4在软骨细胞肥大及软骨细胞增殖中的作用
        3.3 HDAC4促进软骨细胞增殖的机制研究
    4 结论
        4.1 突变HDAC4Caspase-3裂解位点289及14-3-3蛋白结合位点246/467/632,不仅可抑制HDAC4降解,而且可减少HDAC4与14-3-3蛋白在胞浆中的结合,促进HDAC4向软骨细胞核内穿梭,增加细胞核内HDAC4含量
        4.2 与未突变的HDAC4相比,突变的HDAC4抑制软骨细胞肥大促进软骨细胞增殖的能力更强,达到优化软骨组织工程种子细胞(软骨细胞)的作用
        4.3 HDAC4的促增殖作用可能与HDAC4与PCNA的结合有关,且HDAC4与PCNA的结合位点可能在326-669之间
参考文献
综述
    References
致谢
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本文编号：3536765