南极衣藻DNA光修复酶家族及其紫外辐射损伤协同修复机制
发布时间：2021-12-19 00:09
CPD和6-4PPs是紫外辐射造成的DNA损伤产物。光修复酶就是利用光能修复紫外损伤产物CPD和6-4PPs的一类黄素蛋白。根据结合的底物不同,分为CPD光修复酶和6-4光修复酶。我们的实验材料南极衣藻Chlamydomonas sp.ICE-L是从南极中山站附近采集分离而来。南极衣藻长期适应极其恶劣的南极环境,尤其能抵抗南极强紫外辐射,我们推测南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶能修复紫外辐射造成的藻细胞DNA损伤,保证了藻细胞DNA的完整性,光修复酶是南极衣藻适应南极强紫外辐射环境的重要物质。本文对南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶家族进行了初步探究。在我们实验室之前的实验中,已经成功的从南极衣藻C.sp.ICE-L中得到了一个CPD光修复酶并验证了其具有修复CPD的活性。在此基础上,本论文对南极衣藻C.sp.ICE-L转录组进行了检索,得到了南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶家族基因,完成了南极衣藻光修复酶家族各基因的克隆表达及生物信息学分析,重点对6-4光修复酶的活性进行了功能研究。并首次实现了南极衣藻C.sp.ICE-L CPD光修复酶和6-4光修复酶双质粒共表达体...
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
光损伤产物CPD和6-4PPs的化学结构
复酶）的功能并不是完全分化的。显然这些功能在高等植物和哺乳动物中分化之前在其它物种中是共存的[50]。因此研究藻类的光修复酶能够获得关于光修复酶的新的发现。在第18次南极科考时在中山站旁的海冰上采集，并在本课题组中分离出来的南极衣藻C.sp.ICE-L，是南极冰藻类群中数量最多和最具代表性的一种绿藻。南极冰藻是南极环境中的一大类微藻，是南极地区重要的初级生产力；是南极食物链关键物种磷虾的重要食物来源；在海洋生态平衡中起着非常重要的作用。南极衣藻C.sp.ICE-L是一种单胞真核藻，与模式生物莱茵衣藻同属（图2），是研究极端环境适应机制的良好材料[58,59]。图2南极衣藻C.sp.ICE-L显微图片Fig.2MicroscopicmorphologicalobservationofC.sp.ICE-L南极地区的极端环境被认为能够孕育特殊或罕见功能的生物，以适应相应的环境。而且南极地区的物种大都处于未开发的状态，因此开发南极地区的种质资源具有非常重要的意义[60]。除了严寒低温、风大干燥、极低的营养物质这些残酷的生存环境外，南极地区还有很强的紫外辐射[61]。尤其是臭氧层被破坏甚至出现巨大空洞，紫外线显著增强。而在这种严酷的环境中，南极衣藻C.sp.ICE-L依然旺盛生长，使得我们推测南极衣藻C.sp.ICE-L能够适应南极环境的紫外线辐射，一定存在其独特的适应机制。早期的研究聚集在南极衣藻C.sp.ICE-L的细胞提取物，认为藻细胞内的一些提取物对于其在紫外辐射中生存起到了保护作用。随着分子生物学的发展，在南极衣藻C.sp.ICE-L中发现了第一个光修复酶[62]，并且通过鉴定显示了其修复CPD的功能，生物信息学分析表明其是CPD光修复酶II[63]。我们对南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶家族有着极大的兴趣。3
第一部分紫外辐射下南极衣藻嘧啶二聚体的形成与转录组测序2)把提取好的南极衣藻C.sp.ICE-L的每个DNA样品煮10min，然后迅速的进行10min的冰浴，形成DNA单链。3)CPDs的测定采用酶联免疫吸附试验（ELISA）。抗体使用鼠抗CPDs单克隆抗体--小鼠单克隆抗体[H3]toThymineDimer（Abcam）。所有样品进行三次重复且样品随机点在96微孔板上（EvergreenScientific，USA）。4)取50μl的DNA单链于96微孔板中，90℃孵育1-2h，直到96微孔板干燥。ELISA实验使用的单克隆抗体是小鼠单克隆抗体[H3]toThymineDimer（Abcam），二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG（上海生工）。5)加入100μL反应底物（邻苯二胺和用柠檬酸--磷酸盐缓冲液配制的0.007%H2O2），黑暗中37℃，0.5h。加入50μL的2MH2SO4来终止颜色反应。最终得到490nm的数值。4南极衣藻转录组测序南极衣藻C.sp.ICE-L转录组测序由凌恩生物完成。实验以正常培养的光照滤去紫外线，作为对照组。紫外辐射（UVB，波长312nm）设置三个梯度，分别为25，50和75μWcm-2，其它培养条件与正常培养条件一致，每个条件设置三个平行。照射时间为30min。实验结束将藻液离心，干冰运输进行测序。结果1南极衣藻的DNA提取按照Trizol提取DNA的实验步骤提取南极衣藻C.sp.ICE-L的DNA，电泳检测结果见图1.1。结果显示我们得到了纯度较高的南极衣藻DNA。将提取的DNA标记好，保存于-80℃超低温冰箱待用。图1.1南极衣藻C.sp.ICE-LDNA的电泳检测Fig1.1DNAofC..sp.ICE-Ldetectedby1%agarosegelelectrophoresis7
【参考文献】：
期刊论文
[1]DNA光修复酶体外活性的研究[J]. 徐蕾,沐万孟,罗昭锋,王玉珍. 中国药理学通报. 2005(10)
博士论文
[1]大肠杆菌DNA光修复酶（photolyase）的表达纯化及其活性研究[D]. 沐万孟.中国科学技术大学 2006
[2]DNA光解酶作用机理的模型研究[D]. 汤文建.中国科学技术大学 2006
硕士论文
[1]南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L α-碳酸酐酶（α-CAs）的克隆表达及功能研究[D]. 何英英.国家海洋局第一海洋研究所 2017
[2]南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L脂肪酸脱氢酶基因及其细胞膜流动性调控分子机制研究[D]. 綦晓青.国家海洋局第一海洋研究所 2016
[3]南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L光修复酶基因及其修复DNA紫外损伤分子机制研究[D]. 李冲杰.国家海洋局第一海洋研究所 2015
[4]不同生境下南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L不饱和脂肪酸的研究及脂肪酸去饱和酶的功能验证[D]. 安美玲.国家海洋局第一海洋研究所 2014
[5]南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L光保护机制研究[D]. 牟善莉.国家海洋局第一海洋研究所 2012
[6]盐生杜氏藻CPD光裂合酶基因DsPHR2的克隆、差异表达及功能鉴定[D]. 程龙.四川大学 2007
本文编号：3543409
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：117 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
光损伤产物CPD和6-4PPs的化学结构
复酶）的功能并不是完全分化的。显然这些功能在高等植物和哺乳动物中分化之前在其它物种中是共存的[50]。因此研究藻类的光修复酶能够获得关于光修复酶的新的发现。在第18次南极科考时在中山站旁的海冰上采集，并在本课题组中分离出来的南极衣藻C.sp.ICE-L，是南极冰藻类群中数量最多和最具代表性的一种绿藻。南极冰藻是南极环境中的一大类微藻，是南极地区重要的初级生产力；是南极食物链关键物种磷虾的重要食物来源；在海洋生态平衡中起着非常重要的作用。南极衣藻C.sp.ICE-L是一种单胞真核藻，与模式生物莱茵衣藻同属（图2），是研究极端环境适应机制的良好材料[58,59]。图2南极衣藻C.sp.ICE-L显微图片Fig.2MicroscopicmorphologicalobservationofC.sp.ICE-L南极地区的极端环境被认为能够孕育特殊或罕见功能的生物，以适应相应的环境。而且南极地区的物种大都处于未开发的状态，因此开发南极地区的种质资源具有非常重要的意义[60]。除了严寒低温、风大干燥、极低的营养物质这些残酷的生存环境外，南极地区还有很强的紫外辐射[61]。尤其是臭氧层被破坏甚至出现巨大空洞，紫外线显著增强。而在这种严酷的环境中，南极衣藻C.sp.ICE-L依然旺盛生长，使得我们推测南极衣藻C.sp.ICE-L能够适应南极环境的紫外线辐射，一定存在其独特的适应机制。早期的研究聚集在南极衣藻C.sp.ICE-L的细胞提取物，认为藻细胞内的一些提取物对于其在紫外辐射中生存起到了保护作用。随着分子生物学的发展，在南极衣藻C.sp.ICE-L中发现了第一个光修复酶[62]，并且通过鉴定显示了其修复CPD的功能，生物信息学分析表明其是CPD光修复酶II[63]。我们对南极衣藻C.sp.ICE-L的光修复酶家族有着极大的兴趣。3
第一部分紫外辐射下南极衣藻嘧啶二聚体的形成与转录组测序2)把提取好的南极衣藻C.sp.ICE-L的每个DNA样品煮10min，然后迅速的进行10min的冰浴，形成DNA单链。3)CPDs的测定采用酶联免疫吸附试验（ELISA）。抗体使用鼠抗CPDs单克隆抗体--小鼠单克隆抗体[H3]toThymineDimer（Abcam）。所有样品进行三次重复且样品随机点在96微孔板上（EvergreenScientific，USA）。4)取50μl的DNA单链于96微孔板中，90℃孵育1-2h，直到96微孔板干燥。ELISA实验使用的单克隆抗体是小鼠单克隆抗体[H3]toThymineDimer（Abcam），二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG（上海生工）。5)加入100μL反应底物（邻苯二胺和用柠檬酸--磷酸盐缓冲液配制的0.007%H2O2），黑暗中37℃，0.5h。加入50μL的2MH2SO4来终止颜色反应。最终得到490nm的数值。4南极衣藻转录组测序南极衣藻C.sp.ICE-L转录组测序由凌恩生物完成。实验以正常培养的光照滤去紫外线，作为对照组。紫外辐射（UVB，波长312nm）设置三个梯度，分别为25，50和75μWcm-2，其它培养条件与正常培养条件一致，每个条件设置三个平行。照射时间为30min。实验结束将藻液离心，干冰运输进行测序。结果1南极衣藻的DNA提取按照Trizol提取DNA的实验步骤提取南极衣藻C.sp.ICE-L的DNA，电泳检测结果见图1.1。结果显示我们得到了纯度较高的南极衣藻DNA。将提取的DNA标记好，保存于-80℃超低温冰箱待用。图1.1南极衣藻C.sp.ICE-LDNA的电泳检测Fig1.1DNAofC..sp.ICE-Ldetectedby1%agarosegelelectrophoresis7
【参考文献】：
期刊论文
[1]DNA光修复酶体外活性的研究[J]. 徐蕾,沐万孟,罗昭锋,王玉珍. 中国药理学通报. 2005(10)
博士论文
[1]大肠杆菌DNA光修复酶（photolyase）的表达纯化及其活性研究[D]. 沐万孟.中国科学技术大学 2006
[2]DNA光解酶作用机理的模型研究[D]. 汤文建.中国科学技术大学 2006
硕士论文
[1]南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L α-碳酸酐酶（α-CAs）的克隆表达及功能研究[D]. 何英英.国家海洋局第一海洋研究所 2017
[2]南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L脂肪酸脱氢酶基因及其细胞膜流动性调控分子机制研究[D]. 綦晓青.国家海洋局第一海洋研究所 2016
[3]南极冰藻Chlamydomonas sp. ICE-L光修复酶基因及其修复DNA紫外损伤分子机制研究[D]. 李冲杰.国家海洋局第一海洋研究所 2015
[4]不同生境下南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L不饱和脂肪酸的研究及脂肪酸去饱和酶的功能验证[D]. 安美玲.国家海洋局第一海洋研究所 2014
[5]南极冰藻Chlamydomonas sp.ICE-L光保护机制研究[D]. 牟善莉.国家海洋局第一海洋研究所 2012
[6]盐生杜氏藻CPD光裂合酶基因DsPHR2的克隆、差异表达及功能鉴定[D]. 程龙.四川大学 2007
本文编号：3543409
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