DNA修复基因系统及其多态性与乳腺癌相关性病例对照研究

发布时间：2017-05-11 15:08

  本文关键词：DNA修复基因系统及其多态性与乳腺癌相关性病例对照研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：第一部分DNA修复基因系统与乳腺癌相关性研究[背景和目的]乳腺癌是当今世界范围内女性中最常见的肿瘤之一,也是引起女性癌症死亡的主要原因。据世界卫生组织国际癌症研究中心的统计,2008年全球女性乳腺癌新发病例达138万,占全部女性恶性肿瘤发病的22.9%；46万女性因乳腺癌死亡,占所有女性恶性肿瘤死亡的13.7%,占所有女性死亡的1.7%。2010年,在美国,乳腺癌是女性中诊断频率最高的癌症之一,大概有207090的新发病例以及39840例死亡病例报道。乳腺癌的诊断、治疗和生存的异质性问题可部分解释为乳腺癌的生物学和恶性表型变化等特征。虽然乳腺影像学技术的使用已经极大限度的降低了乳腺癌的进展,尤其是对于绝经后的妇女和增加手术与其它治疗方法后的生存期。但是对于绝经前到50岁之间的女性来说,诊断技术的进步并没有带来太大的益处。越来越多的研究结果显示了对于年轻女性和非洲-美洲人群的病因学和乳腺癌的不同的发病机制。据统计,我国每年女性乳腺癌发病16.9万,是女性第二位最常见恶性肿瘤；我国女性乳腺癌死亡约4.5万,是女性第六位最常见的恶性肿瘤死亡原因。随着乳房影像学筛查和诊断技术的进步、综合性的治疗方法的应用等使得乳腺癌的病死率呈现逐渐下降的趋势,但也带来了患者经济上的负担和生存质量下降等问题。乳腺癌的发病机制和病因尚未完全阐明,但目前的研究表明,乳腺癌的发生、发展与各种环境因素、社会因素、人类生活方式的改变以及一些基因方面的变化息息相关。如果能及时认识诱发乳腺癌的危险因素,并加以控制,这对乳腺癌的防治将起到积极的作用。在过去的几十年时间内,许多研究已经证实了生活方式与乳腺癌之间的相关性,表明了不同因素独立的影响效果。研究结果表明,一系列的生活方式,例如：生理活动、饮食、吸烟、激素治疗和精神心理压力的调整等因素都与乳腺癌的发生、发展之间密切相关,并且它们之间具有十分科学的生物学机制。这些结果提示对于绝经后和绝经前的女性,适度的到强烈的体力活动可能降低乳腺癌的患病风险。与此相反的是,高脂肪食物的摄入、饮酒、使用雌激素和孕激素等治疗方法能够增加患病的风险。这些生物-行为上的相互作用机制已经在流行病学等学科中证实了乳腺癌患病的危险性和相互关系。经过人类长时间的努力,在生物行为方面的改变已经显著减少了乳腺癌的罹患水平。但是,癌症的发生和发展是一个多因素参与的多步骤的过程,除了上述生物-行为方面的影响因素之外,来自于人类本身的基因和遗传因素等也与乳腺癌的发生息息相关。人类每天约105个细胞都在经历着各种各样的病变,这些病变是由自然衰退、复制错误、细胞代谢和暴露于放射或化学物质引起的。为了维持细胞的生存和功能,病变细胞必须以特异性的修复机制进行修复。DNA修复机制对于人体基因组的稳定性和完整性是十分重要的,这些机制丢失后可能导致癌症的发生。DNA损伤是由于环境因素诱导产生的,并且是在细胞正常的代谢过程中出现。活性氧物质(ROS)是需氧代谢过程中产生的物质,能够引起碱基损伤和DNA链的损伤。同时还包括了丢失碱基的水解,特别是嘌呤从磷酸二酯键上的水解,以及碱基的脱氨作用和烷基化作用。研究表明,人类每天都有约10万次自然的DNA病变出现。环境类的DNA损伤物质主要包含可见光中的紫外线,它能够引起环丁烷二聚物和氧化碱基的损伤；电离辐射,能够引起ROS大量的聚集,对双链DNA进行破坏；对碱基具有损伤作用的化学物,例如：黄曲霉毒素、苯、氯代甲烷和亚硝胺,这些物质能够破坏碱基配对的能力。因为DNA损伤具有潜在的抑制和改变复制和转录的能力,所以对于不同的和高度可变的损伤过程进行修复就显得十分重要。而且还需要一些旁路修复途径允许复制过程中的一些非配对的损伤。这些修复机制反映了机体经受了大量的DNA损伤累及,同时也突出了修复机制对于维持基因组稳定性的巨大贡献。DNA损伤修复机制包含了核酸切除修复(NER),碱基切除修复(BER),错配修复(MMR)和双链断裂修复(DSBR)。NER途径对由化学物和电离辐射等引起的双螺旋扭曲病变进行修复。NER途径具有清除大量结构非相关的、错误螺旋结构的病变,主要涉及碱基修复和修复、转录失败等过程。NER修复主要针对的是环境相关至突变物造成的致死性或突变损伤,例如：包括CPD和6-4光反应产物在内的紫外损伤,以及化学诱导致癌物产生的加合物。NER途径功能的丢失与着色性干皮病具有相关性,而这一疾病表现为对阳光的过渡反应和对癌症的遗传缺陷。NER途径还具有清除大量的、由C8嘌呤和5’脱氧核糖分子内交联导致的内源性氧化DNA损伤的能力。BER途径针对小的化学损伤进行修复,由氧化应激、水解作用或脱氨作用引起的主要内源性DNA损伤都是通过碱基切除修复(BER)途径进行的。BER修复过程需要连续的5个DNA修复过程,通过葡萄糖基转移酶释放碱基最终由DNA连接酶最终完成缺口的连接。MMR途径修复复制过程中产生的错误,错配修复途径主要清除DNA合成过程中产生的错误或是重组过程中产生的不相同的双链DNA分子。在复制过程中,错配修复仅限于某些诱导突变作用；在重组过程中,错配修复仅发生在异质性DNA链内基因转变的中间物。错配修复机制清除重组开始时,MMR系统会监测不同作用的分子,这一作用能够限制不相同的双链DNA产生。DSBR途径则主要针对细胞周期中不同的阶段而采取不同的修复手段,这一修复途径主要涉及由化学治疗和放射治疗诱导的DNA损伤。DSBR途径包含了同源重组修复(HR)和非同源末端连接(NHEJ)两个亚修复途径。HR途径包含了Rad52系列蛋白,BRCA1/2和XRCC2/3,同时还有EME1和NBS1等基因。研究显示,多种遗传性疾病与HR途径的缺失具有相关性,包括了BRCA1或是BRCA2,二者与遗传性乳腺和卵巢癌有关。与此相反的是,DSBR的NHEJ途径突变的可能性更大,需要参与协调的蛋白质以完成其功能的更多。这些蛋白质包括了Ku异二聚体(Ku70/Ku80),DNA蛋白激酶催化亚单位(DNA-PKcs),连接酶Ⅳ,XRCC4,XLF, Artemis和DNA多聚酶亚单位μ和λ。NHEJ途径成分的突变与机体对放射性的敏感性增加和免疫功能缺陷有关,而完全的丢失NHEJ途径则显示与生命是不相容的。NHEJ与HR途径对于电离辐射诱导的DNA损伤的修复已经成为研究射线敏感药物的靶向目标之一。DNA的双链断裂修复也提高了双链DNA中间体的酶处理过程。DSBR途径针对进行入S期开始DNA复制的细胞进行修复。DSBR还能对活性氧物质、电离辐射或化学物质如拓扑异构酶Ⅰ抑制物或DNA双链中间体等进行修复。对于NHEJ和HR途径的选择主要取决于复杂的调节机制和涉及的53BP1和BRCA1基因等。目前的研究结果表明,DNA损伤修复机制与乳腺癌的发生也具有十分密切的关联。高水平的DNA损伤和DNA修复机制的缺失与乳腺癌的危险性高度相关。在年轻女性的乳腺癌病例中,通过对比研究已经表明了DNA修复能力下降提高了患病的危险性。所以,研究乳腺癌的发生、发展与各类DNA修复基因之间的关系具有十分重要的理论意义和临床实践意义。既往对于DNA修复基因在乳腺癌中的研究已经有了一些报道,但尚未见系统的阐述上述4种类型修复基因与乳腺癌的相关性分析。本研究以此为出发点,全面的研究了4类DNA修复基因与乳腺癌的相关性。研究4类DNA修复机制与乳腺癌的相关性,包括了NER途径中的ERCC2(切除修复交叉互补基因2),ERCC4(切除修复交叉互补基因4),ERCC5(切除修复交叉互补基因5)和XPC(着色性干皮病基因组C);BER途径中的ADPRT(多聚ADP核糖基转移酶),APE1(无嘌呤/嘧啶核酸内切酶1),XRCC1 (X线交叉互补基因1)和POLD1 (DNA多聚酶δ); MMR途径中的MLH1(人类MutL同系物),MSH3 (MutS同系物3)和MSH6 (MutS同系物6)以及DSBR途径中的NBS1 (Nijmegen断裂综合症1)和XRCC3 (X线交叉互补基因3)。[材料与方法]本研究共纳入本院收治的乳腺癌患者共计360例作为研究对象,同时选择在癌旁正常乳腺疾病的其它患者360例作为对照,通过在治疗过程中采集的乳腺癌组织样本和正常组织进行mRNA以及蛋白表达的比较,分析4类DNA修复基因与乳腺癌的相关性。[结果]1.NER途径中ERCC2,ERCC4和ERCC5乳腺癌组织中的mRNA和蛋白表达水平与正常乳腺组织比较差异无统计学意义(P0.05):XPC基因的mRNA和蛋白表达水平与正常乳腺组织比较具有统计学差异(t-XPC-mRNA=60.884,PXPC-mRNA=0.000;χ2XPC-蛋白=39.057,PXP-蛋白=0.000),与正常组织比较其mRNA和蛋白水平均降低。2.BER途径中ADPRT,APE1和POLD1乳腺癌组织中的mRNA和蛋白表达水平与正常乳腺组织比较均有统计学差异(t-ADPRT-mRNA=91.275,PADPRT-mRNA=0.000;t-APE1-mRNA=113.151,PAPE1-mRNA=0.000;t-POLD1-mRNA=102.587,PPOLD1-mRNA=0.000;χ2ADPRT-蛋白=26.639,PADPRT-蛋白=0.000;χ2APEI-蛋白=29.743,PAPE1-蛋白 =0.000;χ2POLD1-蛋白=42.279,PPOLD1-蛋白=0.000),表现为癌组织中的mRNA和蛋白表达均比正常组织升高；XRCC1基因的mRNA和蛋白表达水平与正常乳腺组织比较具有统计学差异(t-XRCC1-mRNA=164.251,PXRCC1-mRNA=0.000;χ2XRCC1-蛋白 =59.854,PXRCC1-蛋白=0.000),与正常组织比较其mRNA升高而蛋白水平则降低。3.MMR途径中MSH3和MSH6乳腺癌组织中的mRNA和蛋白表达水平与正常乳腺组织比较差异无统计学意义(P0.05);MLH1基因的mRNA和蛋白表达水平与正常乳腺组织比较具有统计学差异(t-MLH1-mRNA=100.84,PMLH1-mRNA=0.000;χ2MLH1-蛋白=44.066,PMLH1-蛋白=0.000),与正常组织比较其mRNA升高而蛋白表达水平降低。4.DSBR途径中NBS1乳腺癌组织中的mRNA和蛋白表达水平与正常乳腺组织比较有统计学差异(t-NBS1-mRNA=143.211,PNBS1-mRNA=0.000;χ2NBS1-蛋白=38.172, PMLH1-蛋白=0.000),表现为癌组织中的mRNA和蛋白表达均比正常组织升高；XRCC3基因的mRNA和蛋白表达水平与正常乳腺组织比较无统计学差异(P0.05)。[结论]4类DNA修复途径基因在乳腺癌组织中的mRNA和蛋白表达水平存在显著差异,同一类型的DNA修复途径中的不同基因在癌组织中的表达水平也不一致。第二部分DNA修复基因系统多态性与乳腺癌易感性研究[背景和目的]乳腺癌是当今世界范围内女性中最常见的肿瘤之一,也是引起女性癌症死亡的主要原因。全球每年新增乳腺癌病例约为100万,新增病例主要来自于欧美国家,其中美国有20万,占女性恶性肿瘤的27%；欧洲32万,占女性恶性肿瘤的31%。从20世纪70年代起,原来为低发区的亚洲的乳腺癌发病率出现上升趋势,尤其是日本、新加坡及我国的沿海城市。乳腺癌是一种复杂的疾病,除家族性乳腺癌主要与BRCA1、BRCA2有关外,散发性乳腺癌的发生可能与环境因素有关。肿瘤遗传易感性在分子水平上对于乳腺癌的发生、发展起着重要的作用。人群中个体基因核苷酸序列间的差异称基因多态性。基因多态性主要包括了DNA位点多态性与长度多态性。等位基因在特定位点DNA序列间的差异称作位点多态性,包括点突变、颠换和转换、单个碱基的缺失、置换和插入。人群中正常个体基因组DNA单碱基序列差异的分布频率在1%以上称为单核苷酸多态性SNP。SNP是人类基因组计划研究中一项新的遗传标记。造成基因多态性的原因主要是复等位基因与共显性等。SNP是single nucleotide polymorphism的缩写,是指在基因组上单个核苷酸的变异,形成的遗传标记,其数量很多,多态性丰富。基因组上单个核苷酸的变异,包括置换、颠换、缺失和插入。SNP在基因组中分布相当广泛,近来的研究表明在人类基因组中每300碱基对就出现一次。大量存在的SNP位点,使人们有机会发现与各种疾病,包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看,通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达,但由于它与某些疾病基因相邻,而成为重要的标记。SNP在基础研究中也发挥了巨大的作用。目前的研究表明,一些重要基因的核苷酸多态性与乳腺癌的发生、发展具有密切的关联。例如：乳腺癌中细胞因子相关的基因多态性被认为是潜在的危险因素,细胞因子与肿瘤的发生是肿瘤分子流行病学研究的热点。细胞因子因其作用的广泛性,无论是在乳腺癌的发生及预后中都起着重要的作用。另外一个方面就是细胞色素P450。细胞色素P450 (CYP450)是一类基因超家族酶系,其功能是催化外来化合物进入体内的氧化反应阶段。对于化学致癌物来说,即把无活性的前致癌物激活转变为亲电子化合物,亲电子化合物可攻击细胞内的生物大分子,与DNA或蛋白质形成加合物,最终引起癌基因和抑癌基因的改变,从而导致癌变。而第三个方面就涉及DNA修复系统基因的多态性与乳腺癌易感性之间的关系,目前的研究结果已经表明XRCC1, Rad51以及NBS1等基因的多态性与乳腺癌易感性之间具有统计学关联。高水平的DNA损伤和DNA修复的缺失与乳腺癌的危险性高度相关。暴露于不同的复杂DNA损伤之后,机体需要多种修复途径维持基因组的完整性,这包括了碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MMR)和双链断裂修复(DSBR)。DNA损伤修复是哺乳动物细胞防御机制的重要部分之一,可以逆转由机体内外环境因素所致的DNA突变,在很大程度上保证了遗传物质的稳定性。针对不同的损伤类型,DNA修复机制涉及碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复(NER)、错配修复(MMR)、DNA双链断裂(DSBR)中的同源重组(HR)和非同源末端连接(NHEJ)等。目前,关于乳腺癌易感性基因多态性的研究结果主要集中在BRCA1、BRCA2、XRCC1、NBS1以及TP53这几个基因。目前关于DNA修复基因多态性与乳腺癌易感性之间的研究主要集中在ERCC2, ADPRT和XRCC1这3个基因类型当中,并且已经取得了一定的研究成果。但对于DNA修复系统中其它类型基因多态性与乳腺癌易感性之间的关系尚未见报道。不同的DNA损伤修复途径在维持基因组的稳定性具有重要作用,并且SNPs在多种修复途径中的早期年龄和晚期年龄中的突变都与乳腺癌的发病具有相关性。根据SNP的改变能够导致氨基酸替换和功能改变的理论,我们推测不同修复途径的SNP与乳腺癌之间具有附加的或是多重性的作用和影响。因此,本部分研究内容为开展DNA修复途径基因多态性与乳腺癌易感性之间的相关性分析。[材料与方法]本研究评价了4个DNA修复途径中的18种SNP变化与乳腺癌之间的相关性,即(1) BER:ADPRT V762A (rs1136410), APE1 D148E (rs3136820), XRCC1 R194W(rsl799782)/R280H (rs25489)/R399Q (rs25487)和POLD1 R119H (rs1726801); (2) DSBR:NBS1 E185Q (rs1805794)和XRCC3 T241M(rs861539); (3) MMR:MLH1 I219V (rs1799977), MSH3 R940Q (rs184967)/T1036A (rs26279)和MSH6 G39E(rs1042821)以及(4)NER:ERCC2 D312N (rs1799793)/K751Q (rs13181), ERCC4 R415Q(rs 1800067), ERCC5 D1104H (rs17655)和XPC A499V(rs2228000)/K939Q (rs2228001)。共纳入本院收治的乳腺癌患者共计360例作为研究对象,同时选择在本院就诊的排除乳腺疾病的其它患者360例作为对照,通过在治疗过程中采集的所有患者和对照组患者的外周静脉血标本,采用Sequenom Mass ARRAY时间飞行质谱对各类修复基因的多态性进行研究分析并进行比较。[结果]1.Hardy-Weinberg平衡吻合度检验表示,ADPRT V762A、POLD1 R119H、MLH1 I219V、MSH3 R940Q以及XRCC3 T241M不符合HWE基因平衡。2.应用单因素非条件Logistic回归模型,在a=0.05水平,分析所有18个SNP位点DNA修复基因的多态性与乳腺癌易感性之间的影响。(1)在NER途径中,携带ERCC2 D312N位点的NN和DN/NN等位基因可增加乳腺癌的易感性,相应的OR (95%CI)值为3.66(2.06-6.53)和1.57(1.16-2.10)；(2)在BER途径中,携带XRCC1 R280H HH基因型增加了乳腺癌的易感性,相应的OR (95%CI)值为2.13(1.34-3.41)；(3)在DSBR途径中,携带NBS1 E185Q QQ等位基因增加了乳腺癌的易感性,相应的OR (95%CI)值为4.33(2.04-9.23)。(4)其余DNA修复途径基因的多态性结果与乳腺癌易感性之间均无统计学差异(P0.05)。3.调整年龄、乳腺癌家族史和职业暴露史等环境因素,分别进行多因素非条件Logistic回归分析。将各个位点野生型作为参照后,杂合子和纯合子突变基因型分别于其做比较。在a=0.05水平,同样分析所有18个SNP位点DNA修复基因的多态性与乳腺癌易感性之间的影响。结果显示：(1)在NER途径中的ERCC2 D312N位点的DN, NN基因型和DN/NN等位基因,增加乳腺癌的易感性,相应的OR (95%CI)分别为1.62(1.11-2.36),4.90(2.50-9.63)和1.90(1.35-2.69)；(2)BER途径中的XRCC1 R280H HH和RH/HH等位基因,增加乳腺癌的易感性,相应的OR (95%CI)为2.50(1.42-4.40)和1.63(1.15-2.30)：(3)DSBR途径中NBS1 E185Q QQ和EQ/QQ等位基因均导致了罹患乳腺癌的风险增加,相应的OR (95%CI)为3.87(1.66-9.06)和1.63(1.12-2.35)。(4)其余DNA修复途径基因的多态性结果与乳腺癌易感性之间均无统计学差异(P0.05)。[结论]ERCC2, XRCC1和NBS1这3个基因型的多态性与乳腺癌的发生、发展具有十分重要的联系,其余基因型多态性尚未发现与乳腺癌易感性之间的关系,这对于乳腺癌的一级预防和早期筛查等具有重要意义。
【关键词】：乳腺癌 DNA修复机制 基因多态性 NER BER MMR DSBR
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R394;R737.9
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 前言24-29
• 第一部分 DNA修复基因系统与乳腺癌相关性研究29-51
• 材料与方法31-38
• 结果38-44
• 讨论44-50
• 小结50-51
• 第二部分 DNA修复基因系统多态性与乳腺癌易感性研究51-79
• 材料与方法52-61
• 结果61-73
• 讨论73-77
• 小结77-79
• 全文总结79-82
• 参考文献82-86
• 综述86-107
• 参考文献101-107
• 中英文缩略词107-108
• 致谢108-109

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本文编号：357496