迷走神经调节对重症胰腺炎大鼠早期炎症反应和器官功能的影响

发布时间：2017-05-12 09:17

  本文关键词：迷走神经调节对重症胰腺炎大鼠早期炎症反应和器官功能的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：过度炎症反应及其所致的多脏器功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)是重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis, SAP)早期死亡的重要原因,发病早期控制过度炎症反应是提高SAP生存率的关键。在炎症反应和遭受损伤时,机体通过神经内分泌和免疫系统之间信息交换,调控免疫反应炎症反射,保持内稳态,避免机体遭受进一步侵害。迷走神经介导的炎症反射即胆碱能抗炎通路是机体遭受致命损伤和感染后减轻打击的强大力量,中枢神经系统接收到通过迷走神经传入信号感受到的炎症反应,中枢通过迷走神经传出纤维发出调节信号,迷走神经信号通过T-淋巴细胞上a7烟碱型乙酰胆碱受体,可以减轻外围的免疫反应,包括促炎性细胞因子的产生、白细胞招募和核因子κB激活。激活这一通路或通过迷走神经刺激或α7胆碱能受体激动剂可以防止多个模型的全身炎症反应,减轻休克和败血症中的组织损伤。我们前期研究发现SAP早期交感神经活性增加,加重炎症反应,通过β受体阻滞剂可以减轻炎症反应。迷走神经作为自主神经系统的重要组成部分,与交感神经一起共同维持神经免疫平衡,在动物实验中,切断胰腺炎小鼠迷走神经,淀粉酶明显比对照组升高,但SAP时迷走神经功能状态的变化及其对炎症反应的调节尚不明确。因此,我们设想SAP早期迷走功能状态发生改变,迷走神经功能状态的变化与SIRS与迷走神经功能有关,如果假设成立,通过调节迷走神经兴奋性,就可能为SAP早期控制过度炎症反应、减轻器官功能损害提供了一个新治疗路径。研究目的：1.证实SAP早期迷走神经功能状态的改变,并探讨与全身炎症反应关系；2.通过阻断/增强迷走神经兴奋性,证实迷走神经活性对SAP炎症反应和器官功能的影响及其机制。研究内容如下第一部分SAP大鼠迷走神经功能和炎症反应的关系目的：证实SAP大鼠存在迷走神经功能异常,探讨SAP大鼠迷走神经功能和炎症因子之间的关系。方法：SD雄性大鼠18只,随机分Control组(假手术组)、SAP组(3.5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射,1 ml/kg)和SAP+VGX组(左侧颈迷走神经切断术后2小时,3.5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射,lml/kg)。造模后,行股静脉置管补液,补充生理盐水,速度10ml/kg.h。在模型稳定后Oh、1h、2h、4h和6h检测大鼠的HRV。在模型稳定后4h抽取大鼠的静脉血,检测TNF-α、IL-1β和IL-10水平(ELISA); SAP组大鼠造模4h后肺组织检测MDA, MPO水平。所有计量资料均以均数±标准差表示,使用One-way ANOVA,多组数据间两两比较使用LSD法(SPSS 18.0),p0.05被认为有统计学差异。结果：1、Control组相比,SAP和SAP+VGX组HRV的nHF在模型稳定后0h、1h、2h、4h和6h都明显升高,但SAP+VGX组较SAP组降低,SAP+VGX vs SAP, p 0.05; nLF/nHF在0h、1h、2h、4h、6h都明显升高,SAP、SAP+VGX vs Control , p0.05; SAP+VGX组较SAP组增高,SAP+VGX vs SAP, p0.05o和Control组(127.51±17.28ug/ml)相比,SAP组和SAP+VGX组大鼠造模4h后血清Ach浓度增高,p0.05；但SAP+VGX (136.25±13.91 ug/ml)组较SAP( 165.25±11.93 ug/ml)组降低,* p0.05 VGX+SAP vs.SAP 。2、和Control相比,SAP、SAP+VGX组和Control组大鼠血清TNF-α水平分别为191.0±33.4 pg/ml、272.6±33.5 pg/ml和34.8±3.9pg/ml,与Control组相比,SAP、SAP+VGX组血清TNF-α水平明显增高(p0.05),SAP+VGX组高于SAP组(p0.05)；SAP、SAP+VGX组血清IL-1β水平分别为269.7±26.3 pg/ml和334.8±30.6 pg/ml,与Control组(39.8±6.1 pg/ml)相比,SAP、SAP+VGX组血清IL-1 β水平明显增高(p0.05),SAP+VGX组高于SAP组(p0.05)；SAP、SAP+VGX组血清IL-10水平分别为34.1±3.6 pg/ml,30.6±2.2 pg/ml,和Control(25.2±3.4 pg/ml)相比,SAP、SAP+VGX组无明显统计学差异(p0.05)；造模后4hSAP、SAP+VGX组肺组织MDA、MPO水平明显增高,SAP+VGX组高于SAP组。3、迷走神经活性与炎症介质水平相关性分析,(?)LF/nHF和血清TNF-α水平呈正相关,r=0.837,p0.05；](?)LF/nHF和血清IL-1β水平呈正相关,r=0.827,p0.05；迷走神经在正常对照基础上的变化△nHF与炎症因子TNF-α的增加呈负相关,r=-0.751,p0.05;IL-1β的增加呈负相关,r=-0.870,p0.05。结论：SAP大鼠早期存在自主神经功能失调,表现为交感与迷走神经兴奋性增加,交感神经兴奋性高于迷走神经兴奋性。阻断SAP大鼠迷走神经活性,加重炎症反应,但不改变抗炎因子。第二部分α7nAChR激动剂对SAP大鼠炎症反应和器官功能的影响目的：观察a7nAChR激动剂尼古丁对SAP大鼠炎症反应和器官功能的影响。方法：SD雄性大鼠36只,随机分为三组：Control组、SAP组以及SAP+Nico组各12只,一半用于观察生存率。SAP组即建立SAP大鼠模型并且静脉补充生理盐水,SAP模型建立同研究一。SAP+Nico组在造模稳定后,腹腔注射尼古丁,尼古丁剂量为100ug/kg.h。所有大鼠行股动脉置管持续监测动脉血压,同时监测心率变化。股动脉抽动脉血行血气分析,并处死大鼠取材(造模4h后)。通过血清酶学以及病理评定胰腺炎严重度；通过血气分析、肺干湿重比以及病理评估肺功能情况；通过血生化检验评估肝肾功能。结果：1、腹腔注射a7nAChR激动剂尼古丁4h后,模型处于稳定状态,SAP组大鼠nHF(66.2±2.9nu)相比于Control组(45.5±1.9nu)明显增高(p0.05), SAP+Nicotine组大鼠的迷走神经活性(72.4±1.6nu)相比于SAP组增高(p0.05)。交感/迷走神经平衡性(nLF/nHF) SAP+Nicotine组比SAP组高(1.55±0.11 vs 1.73±0.15, p0.05); SAP组和control组相比,变化更加明显(p0.05)。2、腹腔注射a7nAChR激动剂尼古丁4h后,SAP组、SAP+Nicotine组大鼠血清TNF-α水平比明显增高control组(34.8±3.9pg/ml, p0.05)。而SAP+Nicotine组和SAP组对比,NF-α水平降低有统计学差异(143.4±16.7pg/ml vs191.1±33.4pg/ml,p0.05)；IL-1β水平SAP组.SAP+Nicotine组均高于Control组(39.7±6.1pg/ml,p0.05),SAP+Nicotine组与SAP组(269.7±26.3pg/ml vs 181.9± 22.6pg/ml),IL-1β水平明显降低,p0.05。3、腹腔注射α7nAChR激动剂尼古丁4h后,反应胰腺变化的血清淀粉酶和脂肪酶均发生一定的变化,SAP+Nico组、SAP组大鼠的血清淀粉酶和脂肪酶均高于对照组,但SAP+Nico组较SAP组低；SAP+Nico组胰腺病理评分显示结构损伤(3.25±0.46)和组织坏死(2.12±0.64)均较SAP组结构损伤(3.50±0.53)组织还是(2.63±0.52)降低(p0.05)。反应组织灌注的乳酸水平SAP组大鼠明显低于SAP±Nicotine组大鼠,(3.70±0.32umol/L vs 2.31±0.69 umol/L,p0.05),两组均高于control组(0.50±0.15umol/L,p0.05).肺组织中SAP+Nicotine组、SAP组大鼠的MPO.MDA水平都明显高于对照组(p0.05),SAP+Nicotine组大鼠的肺脏MPO、MDA水平低于SAP组(p0.05)；SAP组、SAP+Nicotine组大鼠的肺W/D高于control组(3.75±0.25,p0.05):SAP组的BE水平明显低于control组(0.28±0.16umol/L),SAP+Nicotine组和SAP组对比,BE值增高(-1.66±0.55umol/L vs-2.5±0.3l umol/L,p0.05)；肺组织病理评分显示炎症反应和局部坏死评分SAP+NicOtine组比SAP组低(p0.05)。肾脏的影响变现如下,SAP+Nicotine组大鼠胱抑素C水平低于SAP组(0.63±0.06 mg/ml vs 0.48±0.05 mg/ml,p0.05),与Control组比较无差异(p0.05).SAP.SAP+Nico组大鼠肝脏病理显示肝细胞水肿、炎性细胞浸润,生化检查SAP+Nicotine组大鼠ALT(91.88±10.37U/L)比SAP组(122.63±15.56U/L)低,(p0.05)；但AST检测：SAP.SAP+Nico组组间无统计学差异(p0.05)。4、腹腔注射尼古丁后SAP+Nico组大鼠最长存活72h,高于SAP大鼠生存率60h,p0.05。结论：α7AChR激动剂激动剂尼古丁能够减轻炎症反应；降低SAP大鼠的胰腺损伤,改善肺、肝、肾器官功能。第三部分迷走神经对SAP大鼠炎症反应调控机制的探讨目的：探讨迷走神经兴奋性对SAP炎症反应调控的机制。方法：实验动物造模同研究一,尼古丁腹腔注射；随机分为五组,每组6只：Control组、SAP组以及SAP+Nico组(50ug/kg) 、SAP+Nico组(100ug/kg)、SAP+Nico组(300ug/kg);造模4h后取材,取外周血和胰腺,流式细胞仪对CD4+CD25+T细胞计数,检测FOXP3、CTLA-4蛋白表达水平,荧光定量PCR检测FOXP3、CTLA-4 mRNA水平(相对定量)。各检测指标以标准对照组检测参数为基数参照对比,设基数水平为1,数据以均数±标准差表示,SPSS 13.0统计软件多组间单向方差分析(LSD法),秩相关检测各研究数据间相关性。结果：1、腹腔注射尼古丁后4h, SAP组外周血CD4+CD25+表达水平明显低于对照组,Nico(100ug/kg)组(0.61±0.04)、Nico(300ug/kg);组(0.82±0.03)的CD4+CD25+表达水平高于于SAP组(0.45±0.06,p0.05),具有随着尼古丁剂量增加而增高趋势。2、FOXP3、CTLA-4蛋白在这三组大鼠表达水平的变化趋势同CD4+CD25+。腹腔注射尼古丁后4h,FOXP3表达水平,Nico(100ug/kg)组(0.90 ± 0.06)、Nico (300ug/kg)组(1.18±0.07)高于SAP组(0.78±0.03, p0.05); CTLA-4 mRNA水平Nico (100ug/kg)组(0.89±0.03)、Nico (300ug/kg)组(1.18±0.08)高于SAP组(0.70±0.03) , (p0.05) ; Nico (100ug/kg)组F0XP3、CTLA-4蛋白表达水平与SAP组无差异(p0.05) ; F0XP3、CTLA-4蛋白表达水平与尼古丁剂量呈浓度依赖性。F0XP3、CTLA-4 mRNA表达水平均高于SAP组,p0.05。3、相关性分析发现,尼古丁浓度与CD4+CD25+表达F0XP3 mRNA水平呈正相关,r=0.962, p0.05% CD4+CD25+表达F0XP3、CTLA-4蛋白水平随着F0XP3 mRNA水平增加而增加,r=0.912,p0.05；F0XP3蛋白水平与炎症介质水平负相关,随着FOXP3蛋白表达增加炎症介质TNF-α水平下降,r=-0.844,p0.0.05。在CTLA-4系列表达水平与F0XP3具有相同的趋势。结论：烟碱受体激动剂上调SAP大鼠外周血T淋巴细胞CD4+CD25+水平,促进CD4+CD25+表达FOXP3和CTLA-4; F0XP3和CTLA-4的表达水平增加与促炎因子降低密切相关。
【关键词】：重症急性胰腺炎(SAP) 迷走神经 心率变异性(HRV) 炎症因子 烟碱 α7nAChR激动剂 器官功能 CD4~+CD25~+ FOXP3 CTLA-4
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R576
【目录】：

• 缩略词表6-8
• 摘要8-15
• Abstract15-25
• 前言25-31
• 参考文献28-31
• 第一部分 SAP大鼠迷走神经功能状态及其和炎症反应的关系31-49
• 一、材料和方法31-38
• 二、结果38-45
• 三、讨论45-47
• 四、小结47
• 参考文献47-49
• 第二部分 α 7nAChR激动剂尼古丁对SAP大鼠炎症反应、器官功能的影响49-67
• 一、材料和方法49-53
• 二、结果53-61
• 三、讨论61-63
• 四、小结63
• 参考文献63-67
• 第三部分 α 7nAChR激动剂对SAP大鼠炎症反应改变机制探讨67-82
• 一、材料和方法67-74
• 二、结果74-78
• 三、讨论78-80
• 四、小结80
• 参考文献80-82
• 全文总结82-83
• 综述83-92
• 参考文献88-92
• 发表文章目录92-93
• 致谢93-94

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