慢性硬膜下血肿大鼠动物模型的改良及CXCR4在其血肿吸收中的调控作用

发布时间：2017-05-12 11:10

  本文关键词：慢性硬膜下血肿大鼠动物模型的改良及CXCR4在其血肿吸收中的调控作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:慢性硬膜下血肿(chronic subdural hematoma,CSDH)是继发性颅脑损伤的主要类型之一,好发于有抗凝治疗史、颅脑创伤史者以及65岁以上的老年人,当前CSDH以钻孔血肿引流术为主的外科治疗,往往伴有不同程度的神经系统及呼吸系统并发症,均造成手术致残率与死亡率上升,但因多年来囿于其现有动物模型的局限性,CSDH发病机制及治疗方法的研究并未获得实质性进展。趋化因子受体4(CXCR4)是体内参与炎症反应、血管生成、创伤修复等多种生理及病理生理过程的重要调节分子,并与出血性及缺血性疾病的发生发展关系密切。因此,本课题利用更能模拟人体CSDH发病时程的大鼠模型及临床CSDH病人标本的检测,深入研究CSDH发病机制及CXCR4在血肿吸收过程中的重要调控作用,同时结合观察临床CSDH病人标本中与炎症反应、血管生成密切相关的Treg、EPC变化,为将来探索出有利血肿吸收、促进疾病康复的临床治疗方法及有效药物提供科学依据。方法:分为基础及临床研究两部分。基础研究部分:在立体定向仪及微量注射器辅助下建立Wistar大鼠CSDH模型,将受试大鼠随机分为三组:假手术组、CSDH组及CXCR4特异性抑制剂AMD3100组。其中,CSDH组大鼠分2次、间隔72小时向颅内硬膜下腔注入大鼠自体静脉血;AMD3100组大鼠在CSDH造模前2小时,预先使用大鼠体重剂量2.5 ug/kg的CXCR4特异性阻断剂AMD3100进行单次硬膜下腔微量注射预处理,之后处理同CSDH组;sham组大鼠除不进行颅内注血外,其余处理同CSDH组。观察时间分别设定在模型制备开始后第1、3、10、17、24天(其中1~10天为急性期、17天为亚急性期、24天为慢性期):(1)通过3.0T MRI扫描,确定模型建立是否成功,并在各时点观察其影像学特征,测量CSDH血肿体积;(2)通过石蜡切片及HE染色观察CSDH血肿及周围区形态结构变化;(3)ELISA方法检测血肿包膜及周围脑组织炎症因子和血管生成因子IL-6、8、10、13、VEGF、TNF-α的表达变化;(4)流式细胞检测技术观察外周血调节性T细胞(Treg)及内皮祖细胞(EPC)及的比例变化;(5)通过Western Blot检测大鼠血管内皮细胞标记物v WF以及CXCR4的蛋白表达变化;(6)通过m NSS神经功能评分、Footfault运动能力实验以及Morris水迷宫检测大鼠神经功及认知功能变化;(7)通过统计学分析探讨大鼠CSDH形成及吸收过程中与炎症反应、血管生成相关的病理生理机制,初步探索CXCR4与二者相关的分子调控机制。临床研究部分:募集24例临床钻孔引流术治疗的CSDH患者及30例健康志愿者,记录患者一般资料后,MRI观察患者血肿体积、GOSE评测患者术后神经功能,流式细胞学方法检测患者外周血Treg及EPC水平,研究Treg、EPC与血肿体积、神经功能之间的相互关系。结果:(1)利用立体定向仪及微量注射器,采用间断多次及速度梯度注血法,模仿CSDH病人反复多次颅内出血,成功制备出了血肿维持24天的CSDH大鼠模型,并在血肿形成过程的第1、3、10、17、24天对其进行连续动态观察。(2)CSDH大鼠头部MRI及脑组织切片HE染色显示,CSDH及AMD3100组血肿体积均在第3天达到峰值,之后逐渐减小,AMD3100组血肿吸收较CSDH组明显延迟,第10~24天其血肿体积明显增加(P0.05)。(3)CSDH大鼠神经及认知功能同期较sham组均显著下降(P0.05),而AMD3100组与CSDH组相比,多个时间点其神经与认知功能均同期降低(P0.05)。(4)与sham组相比,CSDH组促炎因子IL-6、IL-8及TNF-α水平均显著升高(P0.05),在第3~10天达到峰值;相比CSDH组,AMD3100组IL-6、IL-8及TNF-α水平升高更明显,以IL-8、TNF-α为著,尤其第17~24天差异最显著(P0.05)。CSDH组抗炎因子IL-10、IL-13水平较sham组升高,第17天达峰值,第10~24天差异最为明显(P0.05);AMD3100组IL-10、IL-13水平较CSDH组1~10天无明显变化,第17~24天下降明显(P0.05)。IL-6、8、及TNF-α水平与血肿体积及神经功能减退程度呈正相关,IL-10、13与之呈负相关。(5)与sham组相比,CSDH组EPC水平呈现先降后升的趋势,第1~3天下降,第10天达到峰值,此后逐渐下降,第10~24天仍持续保持较高水平(P0.05),AMD3100组较CSDH组,第10~24天EPC水平则明显下降(P0.05);Treg比例亦呈先降后升,CSDH组较sham组第1~10天下降,第17~24天显著升高(P0.05),而与CSDH组相比,AMD3100组Treg水平在第10~24天明显降低(P0.05)。Treg及EPC水平与血肿体积、神经功能减退程度呈负相关。(6)v WF表达水平在CSDH第3~24天逐渐升高(P0.05),第24天水平最高,AMD3100组v WF水平在各时间点明显低于CSDH组(P0.05,P0.05,P0.05,P0.05);CXCR4表达水平在CSDH组逐渐升高,第17天达峰值,此后保持较高水平(P0.05),而AMD阻断之后CXCR4水平则明显降低(P0.05)。(7)CSDH患者术前Treg与EPC水平下降,术后逐渐升高,二者水平与患者术前血肿体积及神经功能下降程度呈负相关。结论:CXCR4可能通过细胞及细胞因子途径参与CSDH炎症反应及血管生成,进而促进了CSDH血肿的吸收,并有益于CSDH神经功能的保护和改善。
【关键词】：慢性硬膜下血肿 大鼠模型 CXCR4 炎症反应 血管生成
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R651.15;R-332
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-16
• 缩略语/符号说明16-18
• 前言18-21
• 研究现状、成果18-20
• 研究目的、方法20-21
• 一、CSDH大鼠模型的制备及颅内血肿的观察21-32
• 1.1 材料与方法21-27
• 1.1.1 主要试剂21
• 1.1.2 实验动物21
• 1.1.3 主要仪器21-22
• 1.1.4 实验分组22
• 1.1.5 CSDH造模、预处理及颅内血肿观察纲要22
• 1.1.6 实验过程及详细步骤22-27
• 1.1.7 结果统计27
• 1.2 结果与分析27-32
• 1.2.1 CSDH造模后各组血肿体积变化及结构特点27-32
• 二、CSDH大鼠神经与认知功能变化的观察32-39
• 2.1 材料与方法32-36
• 2.1.1 mNSS量表及使用方法32-33
• 2.1.2 Foot-fault运动能力实验33-34
• 2.1.3 Morris水迷宫实验34-35
• 2.1.4 结果统计35-36
• 2.2 结果与分析36-39
• 2.2.1 mNSS神经功能评分结果36
• 2.2.2 Foot-fault运动能力评测结果36-37
• 2.2.3 Morris水迷宫实验检测结果37-39
• 三、CSDH大鼠CXCR4表达变化及其对炎症反应的影响39-56
• 3.1 材料与方法39-49
• 3.1.1 主要试剂39-40
• 3.1.2 实验动物40
• 3.1.3 主要仪器40
• 3.1.4 实验分组40
• 3.1.5 Western blot检测血肿包膜及周围区脑组织CXCR4表达40-44
• 3.1.6 流式细胞检测外周血Treg比例44-47
• 3.1.7 ELISA法检测CSDH血肿包膜及周围区炎症因子活性47-49
• 3.1.8 结果统计49
• 3.2 结果与分析49-56
• 3.2.1 CXCR4的表达变化及其与CSDH血肿体积、动物神经功能的关系49-50
• 3.2.2 外周血Treg细胞比例检测结果50-51
• 3.2.3 ELISA检测CSDH大鼠血肿包膜及周围区炎症因子的表达51-55
• 3.2.4 Treg及炎症因子与血肿体积、神经功能、CXCR4的相关性分析55-56
• 四、CSDH大鼠血管生成的变化及CXCR4对其影响56-63
• 4.1 材料与方法56-58
• 4.1.1 主要试剂耗材56
• 4.1.2 实验动物56
• 4.1.3 主要仪器56
• 4.1.4 实验分组56
• 4.1.5 Western blot检测vWF表达水平56
• 4.1.6 流式细胞检测外周血EPC比例56-58
• 4.1.7 ELISA检测CSDH血肿包膜及周围区VEGF活性58
• 4.1.8 结果统计58
• 4.2 结果与分析58-63
• 4.2.1 血管内皮标记物vWF的表达变化58-59
• 4.2.2 外周血EPC的比例检测结果59-60
• 4.2.3 血肿包膜及周围脑组织VEGF的检测结果60-62
• 4.2.4 EPC、VEGF及vWF表达水平与血肿体积、神经功能相关性分析结果62-63
• 五：CSDH临床患者外周血及血肿液中Treg及EPC的观察63-73
• 5.1 材料与方法63-65
• 5.1.1 主要试剂耗材63
• 5.1.2 观察对象的选择63-64
• 5.1.3 主要仪器64
• 5.1.4 分组64
• 5.1.5 CT观察CSDH患者颅内血肿情况64
• 5.1.6 流式细胞检测外周血EPC、Treg比例64-65
• 5.1.7 受试者神经功能的评价65
• 5.1.8 结果统计65
• 5.2 结果与分析65-73
• 5.2.1 观察对象基本情况、血常规、肝功能的对比65-68
• 5.2.2 CSDH患者手术前后CT影响比较血肿吸收情况68-69
• 5.2.3 观察对象Treg及EPC的情况69-73
• 讨论73-84
• 1.CSDH及其动物模型的研发现状73-75
• 1.1 CSDH现状73
• 1.2 CSDH动物模型的研发现状73-75
• 2.CSDH的主要病理生理机制75-79
• 2.1 CSDH中炎症反应的作用与影响75-77
• 2.2 CSDH中血管生成的作用与影响77-79
• 3.CXCR4及其在CSDH中的作用79-84
• 3.1 CXCR4的生物学功能79-80
• 3.2 CXCR4对CSDH炎症反应的影响80-82
• 3.3 CXCR4对CSDH血管生成的影响82-84
• 小结84-85
• 全文结论85-86
• 论文创新点86-87
• 参考文献87-92
• 发表论文和参加科研情况说明92-93
• 附录93-95
• 综述 血管生成在慢性硬膜下血肿的中意义及分子病理机制95-105
• 综述参考文献101-105
• 致谢105

【共引文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 巩祖顺;动脉粥样硬化中几丁质酶3样蛋白1的组织学表达及干预研究[D];山东大学;2014年

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 张晓歌;PLGF参与AngⅡ诱导心脏成纤维细胞激活的实验研究[D];重庆医科大学;2013年

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本文编号：359592