Stk40调控中胚层发育的功能和机制的研究

发布时间：2022-01-19 16:38

　　Stk40（Serine/threonine kinase 40）是一个含有丝氨酸/苏氨酸激酶结构域的假激酶。此前,本课题组在研究小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells,mESCs）多能性转录因子Oct4的下游靶基因时,发现Stk40受到Oct4的直接调控。Stk40上调会激活Erk/MAPK信号通路,诱导mESC向胚外内胚层分化。对Stk40基因敲除(Stk40 knock out,Stk40^-/-)小鼠的研究表明,Stk40^-/-小鼠出现肺部发育障碍,导致出生后很快死亡。对Stk40生理功能的研究表明,Stk40抑制小鼠脂肪细胞的分化,促进骨骼肌细胞的成熟。同时红细胞的成熟过程也需要Stk40的参与。考虑到上述脂肪、肌肉和造血细胞都来源于中胚层,基于Stk40的这些功能,我们推测Stk40可能在中胚层分化中发挥重要作用。本研究通过体内和体外分化实验证明,Stk40缺失导致中胚层细胞分化受阻。在mESC向中胚层细胞分化的过程中,敲除Stk40导致表达中胚层标志基因T（Brachyury）的细胞数量减少,中胚层相... 

【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

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【学位级别】：博士

【部分图文】：

STK40蛋白保守序列示意图[4]

博士学位论文Stk40调控中胚层发育的功能和机制的研究胡静8异都可能使Stk40失去结合ATP和2价金属离子的能力。虽然一些假激酶在DFG结构域突变后，在特定条件下仍然能发挥激酶的功能[5]，但是目前的研究发现STK40的激酶结构域缺乏与ATP结合的能力，而且在体外激酶反应中STK40没有自我磷酸化的能力[6]。图2.STK40蛋白序列与经典激酶序列比对示意图[4]Figure2.Multiplesequencealignmentofcanonicalkinasemotifs我们的体外激酶实验发现，在293FT细胞中过表达纯化的Stk40蛋白，western-blot结果显示其特异的磷酸化修饰条带，这说明Stk40能被磷酸化修饰。质谱实验的结果也说明Stk40可能在第6位和第250位丝氨酸上有磷酸化修饰。这些实验结果表明，虽然Stk40是缺乏激酶活性的假激酶，但是它本身可能被其它激酶磷酸化修饰。1.1.2Stk40的功能在我们实验室此前的研究中，通过染色质免疫共沉淀技术发现Stk40为Oct4的下游靶基因[7]。Oct4结合Stk40的基因调控序列并抑制其转录。进一步的研究发现Stk40通过与Rcn2相互作用激活MAPK信号通路，促进mESCs向胚外内胚层分化（图3）。

博士学位论文Stk40调控中胚层发育的功能和机制的研究胡静9图3.Stk40在胚外内胚层分化过程中的功能[7]Figure3.AmodelforthefunctionofStk40inextraembryonicdifferentiation在小鼠胚胎发育第18.5天检测各个器官和组织中Stk40的蛋白表达水平，可以发现Stk40广泛表达，说明Stk40可能参与了多个器官组织的正常发育（图4）。为了进一步验证Stk40的功能，Yu等构建了Stk40基因敲除的小鼠，策略如下：用大肠杆菌半乳糖苷酶（LacZ）和抗性基因Neomyocin序列同源重组替换基因组上Stk40的第二和第三个外显子基因序列（图5）。图4.Stk40蛋白在胚胎发育18.5天时各组织器官中的表达情况[8]Figure4.ProteinlevelsofStk40indifferenttissuesandorgansisolatedfrommouseembryosatE18.5图5.Stk40基因敲除策略[9]


本文编号：3597200