红花多糖对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的调节作用

发布时间：2017-05-13 05:16

  本文关键词：红花多糖对乳腺癌细胞MCF-7增殖和凋亡的调节作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：[背景]乳腺癌是女性中发病率最高而死亡率仅低于肺癌的、严重危害女性健康的恶性肿瘤,每年全世界有超过130万女性新诊断为乳腺癌,约50多万女性死于乳腺癌。随着生活方式的急剧变化和生态环境的急剧恶化,我国乳腺癌发病率呈现比较明显的上升趋势,每年有高达3-4%的新增病例,成为了我国发病率上升最快的恶性肿瘤之一,而且有呈年轻化的趋势,我国女性乳腺癌病人的发病中位年龄约比西方提前了十年。因此,阐述乳腺癌发病机制,控制乳腺癌发生率,提高乳腺癌治疗效果,降低乳腺癌死亡率己成为亟待解决的重大课题。外科手术是乳腺癌的公认根治性治疗手段,但单纯手术无法有效改善乳腺癌患者预后,癌细胞的复发和转移是导致预后不良的主要因素。放化疗可有效提高局部控制率,改善远期生存率,是乳腺癌临床治疗的重要辅助手段。但长期放化疗具有严重的毒副反应,并大大提高肿瘤组织的放化疗抵抗作用,因此需探讨更有效的辅助治疗手段。细胞凋亡是指机体为维持内环境稳定,在某些生理因素作用下,通过体内外因素共同而引发的细胞自主的有序的死亡,该过程亦被称为细胞程序性死亡。这是个井然有序的过程,并不是病理条件下地损伤现象。细胞凋亡与细胞坏死不同,细胞凋亡不是一件被动的过程,而是主动过程,它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡在机体维持自身动态平衡中发挥重要作用。发生凋亡的细胞大多数是生物个体中多余或老化的细胞,也有可能是发生肿瘤时的细胞或受到病毒或细菌感染的细胞。许多情况下,细胞凋亡是对来自其他细胞或循环境中的信号所作出的一种反应。肿瘤的发生和发展是细胞过度增殖和细胞凋亡通路受阻共同作用的结果。细胞凋亡(apoptosis)及其在肿瘤发生和治疗中的作用越来越受到关注,同时基于促肿瘤细胞凋亡机理的肿瘤生物治疗也有重要进展。细胞周期(cell cycle)是生命体一代向下一代传递的连续过程中最基本也是最重要的过程。该过程从细胞一次分裂完成开始,到下一次细胞分裂结束,其中DNA合成和细胞分裂是细胞周期的两个重要阶段,包含G1期、S期、G2期和M期。在物种的不断进化中,为了确保细胞周期严格遵循有序交替和各时相依次有序变更的生理过程,生命体细胞发展并建立了一系列的调控机制。当受到机体内外某些因素刺激而使调控细胞周期的分子网络成员发生异常改变时,细胞周期失调,导致细胞不协调地增生,DNA受损等异常情况,致使异常细胞不能凋亡,从而导致了肿瘤的发生。由此可见,细胞周期的失调和肿瘤的发生紧密关联。因此,细胞周期对认识肿瘤发生和演进、临床诊断与治疗有十分重要的意义。中药红花(Safflower)又称红蓝花、草红花,为菊科植物,是我国传统中药材,其性温,味辛,具有活血化瘀、通经止痛之功效。红花在我国大部分地区均有分布,其中以新疆、四川等地最多。现代药理学研究证实,红花中包含多种生物活性成分,如红花多糖(Safflower polysaccharide)、黄酮类(flavone)、红花黄色素(Safflower yellow)、有机酸(Organic acid)、红花苷(Safflower carthamin)等。大量研究显示,红花多糖具有多种药理学活性,如抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、降血压及免疫调节等。由于红花多糖具有资源丰富、毒副作用小、安全性高、且易于工业化生产等优势,受到广泛关注。此外,红花多糖与化疗药物联用,具有增强其药效、降低其毒副作用的辅助功能。前期研究证实,红花多糖可通过调节细胞凋亡及细胞周期,实现对胃癌、肝癌等恶性肿瘤细胞的体外抑制作用,但其对乳腺癌细胞的作用及其机制尚未明确。[目的]本研究旨在探讨水提醇沉法提取红花多糖的效果,以人乳腺癌MCF-7细胞为研究对象,探讨红花多糖体外对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响,并在此基础上研究红花多糖对人乳腺癌细胞凋亡相关因子的影响,以期为乳腺癌的临床治疗探索新的思路和方法,也为中药多糖的临床应用的提供可靠实验依据。[方法]第一部分：选取中药红花为原材料并以沸水煎煮,采用旋转蒸发仪将所得药液进行浓缩,采用水提醇沉法提取粗多糖,之后经反复冻融除去杂质、Sevage法除蛋白、脱色、洗涤等步骤,最终获得精制红花多糖。采用硫酸-苯酚法测定所得精制红花多糖中的多糖含量。用分析天平称取红花多糖样品20 mg于100mL容量瓶中,加入蒸馏水将其稀释至刻度线,充分搅拌使其溶解。用移液管精确量取红花多糖溶液1.0 mL,并向其中加入1.0 mL双蒸水、1.0 mL 6%苯酸以及5.0 mL浓硫酸。在490 nm波长处测定其吸光度并根据回归方程得出多糖的含量。第二部分：选取人乳腺癌MCF-7细胞为研究对象,将MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中静置培养,待细胞密度长至80%时对其进行分组、给药并设立空白对照组和不同浓度的红花多糖组(0.06mg/mL、0.12mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.00mg/mL、2.00 mg/mL)。待MCF-7细胞给药后12h、24h、48h、和72h用倒置显微镜观察各时间点的细胞数量和形态,并拍照记录。采用MTT比色法对红花多糖作用后MCF-7细胞的增殖情况进行检测,采用流式细胞术对其细胞周期和凋亡情况进行检测。第三部分：选取人乳腺癌MCF-7细胞为研究对象,将MCF-7细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中静置培养,将对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7接种于培养瓶中,待细胞培养24 h后将细胞培养液更换为含0.4%胎牛血清的RBMI 1640培养液,继续培养24 h；然后加入不同浓度的红花多糖(0.12mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.00mg/mL、 2.00 mg/mL),分别培养48h收集细胞。一部分用药物处理后的乳腺癌MCF-7细胞提取总蛋白,用Western Blot法测定Bax、Bcl-2、p53蛋白的表达。另一部分用药物处理后的乳腺癌MCF-7细胞用于提取总RNA,采用RT-PCR法,以β-actin为内参基因,分析红花多糖作用后的乳腺癌MCF-7细胞内Bax、Bcl-2、p53基因的表达情况。应用Real-time PCR检测各组细胞的Ct值(Cycle threshold),用内参基因β-actin对所得数据进行均一化处理,以此分析各细胞凋亡相关因子mRNA表达变化情况。第四部分：选取乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤模型为研究对象,设立对照组和不同浓度的红花多糖(0.12mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、 1.00mg/mL、2.00mg/mL)干预组,进行连续14d的药物干预治疗。比较各组小鼠一般情况、体重、瘤重、瘤体积及抑瘤率。[结果]第一部分：450.16g生药红花经水提醇沉,得到的红花多糖为26.1g,多糖得率为5.79%。获得的多糖溶于水后在蛋白质、多肽和核酸的吸收峰260 nm和280 nm处无紫外吸收,说明所得到的多糖纯度较好,不含蛋白质、多肽和核酸等杂质。硫酸-苯酚法检测结果显示,上述所提取精制红花多糖中红花多糖的含量为91.2%。第二部分：正常生长的MCF-7细胞贴壁均匀生长,细胞呈典型的上皮样贴壁生长,细胞排列密集、整齐,轮廓清楚,多数细胞处于旺盛的生长期和分裂期,死亡或者凋亡的细胞少。与正常癌细胞相比,经红花多糖作用后人乳腺癌细胞生长状态不佳,表现为细胞萎缩,形状不规则,贴壁能力降低并见部分细胞漂浮,细胞核多见固缩,细胞间隙增大,核比例减小。上述现象具有时间和剂量依赖性。0.06 mg/mL～1.00mg/mL红花多糖作用72时,人乳腺癌细胞系MCF-7的生长抑制率逐渐上升,并呈现较明显的剂量依赖性。在1.00mg/mL红花多糖浓度时,抑制率最高,为75%；0.50mg/mL 与 1.00mg/mL红花多糖浓度对人乳腺癌细胞系MCF-7的抑制率没有显著性差异(P0.05)；但是当浓度达到2.00mg/mL时,红花多糖对MCF-7细胞的抑制率有所下降,且与1.00mg/mL红花多糖组存在显著性差异(P0.05)。根据不同浓度的红花多糖对MCF-7细胞生长抑制情况,用IC50计算软件计算出红花多糖用于人乳腺癌细胞MCF-7 72小时后半数抑制浓度IC50别为：0.4154mg/ml。在一定浓度范围内,红花多糖的抑制作用与多糖浓度和作用时间呈正比关系。红花多糖浓度在0-1.00 mg/mL以内,作用于MCF-7在48h内,随着红花多糖浓度的增加,对MCF-7有显著抑制(P0.05)；当多糖浓度大于1.00mg/mL时,MCF-7的抑制率没有明显的增加。当红花多糖浓度达到1.00 μg/mL,作用于MCF-7细胞48h时,抑制率效果最好。红花多糖在体外对人乳腺癌细胞能显著的诱导MCF-7细胞发生凋亡,且在一定浓度范围内,其作用与红花多糖浓度和作用时间的呈正比关系。红花多糖浓度在0-1.00mg/mL时,作用于MCF-7在48h内,随着红花多糖浓度的增加,能显著的诱导MCF-7发生凋亡。当红花多糖浓度超过1.00mg/mL时,MCF-7的抑制率无明显增加。当红花多糖浓度达到1.00 mg/mL,作用于MCF-7 48h时,诱导的细胞凋亡率最高。随着红花多糖浓度增加,S期和G2期细胞相应减少,而G1期细胞逐渐增多。在低浓度时(0.12,0.25 mg/mL),红花多糖对G1期细胞数量无影响。当红花多糖浓度达到0.5mg/mL时,G1期细胞的数量明显增加(P0.05)。提示人乳腺癌细胞分裂增殖活动因细胞周期停滞而减弱,大部分细胞都被阻滞在G1期。第三部分：本研究分别采用琼脂糖凝胶电泳、分光光度法测定了RNA样品的完整度、浓度和纯度。经分光光度计于260 nm和280nm波长处测定RNA样品的OD260/280比值均在1.8～2.0范围内,同时根据OD260计算RNA样品浓度,将RNA样品的浓度调整至500 ng/μL；琼脂糖凝胶电泳结果表明,28S rRNA与18S rRNA的亮度比值约为2：1,说明本研究所提取的RNA样品质量较好,未被降解。RT-PCR检测Bax、Bcl-2、p53mRNA的表达情况显示,空白对照组和红花多糖组作用48h后,Bax、Bcl-2、p53 mRNA在MCF-7细胞内均有不同程度的表达。与对照组相比,经1.00 mg/mL和2.00mg/mL红花多糖作用48h后,Bax mRNA表达明显增加,且具有显著性差异(P0.05)；而0.12、0.25和0.5 mg/mL红花多糖试验组,无显著性差异(P0.05)；与空白组相比,0.25、0.50、1.00和2.00 mg/mL的四组红花多糖实验组在经过48h作用后后,细胞内p53 mRNA表达量均显著增高,与空白组相比差异显著(P0.050,仅0.12 mg/mL试验组无明显差异(P0.05)。经1.00、2.00 mg/mL红花多糖作用48h后,Bcl-2 mRNA的表达量相较于空白组显著减少,差异有统计学意义(P0.05),而0.12、0.25和0.50mg/mL红花多糖试验组较空白组差异不显著(P0.05)。本研究应用Western blot法分析了Bax、Bcl-2和p53蛋白在红花多糖作用乳腺癌MCF-7细胞后的表达情况。结果显示：在体外,红花多糖能提高MCF-7细胞对Bax和p53蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达。从图4-2可以看出在浓度为1.00和2.OOmg/ml时,能显著的减少Bcl-2蛋白的表达,Bax和p53显著性的增加,这个结果与检测mRNA表达量的结果一致。第四部分：对照组裸鼠食欲明显下降、被毛凌乱、不同程度消瘦、反应迟钝、行动迟缓。各试验组裸鼠饮水、采食等生活质量均未受到明显影响,且精神状态、反应速度及行动能力均优于对照组。与对照组相比较,试验组各组体重、抑瘤率明显提高,瘤重及瘤体积明显降低,并呈明显剂量依赖性,组间比较差异显著(P0.05)。[结论]采用水提醇沉法制取红花多糖,多糖产量高、纯度好,并且具有简便可靠、稳定性强、灵敏度高以及重现性好的特点,可为红花多糖的提取提供相关的技术支持,也为充分开发和利用红花资源提供理论依据和数据支持。红花多糖对人乳腺癌MCF-7细胞具有显著的抑制作用,且在一定范围(1.00mg/ml,48h)之内,随着红花多糖浓度的升高、时间的延长作用抑制作用越强。红花多糖能把人乳腺癌细胞MCF-7阻滞于G1期,使细胞在该期发生调亡,且细胞凋亡程度与红花多糖的浓度有关。红花多糖作用于乳腺癌细胞MCF-7,可显著上调p53mRNA 及 Bax mRNA的表达水平,下调Bcl-2 mRNA表达水平,而且这种调节作用存在浓度依赖关系。调节凋亡基因表达可能是红花多糖发挥抗肿瘤作用的主要机制之一。红花多糖可有效改善乳腺癌MCF-7细胞皮下移植瘤裸鼠生活质量,抑制体重降低和肿瘤生长,且并未引发明显毒性反应,具有较好的体内抑瘤作用。
【关键词】：红花多糖 乳腺癌 细胞凋亡 细胞周期 Bcl-2 p53
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-21
• 第一章 文献综述21-39
• 1.1 乳腺癌的危害21
• 1.2 肿瘤的发生机制21-22
• 1.3 肿瘤增殖与细胞凋亡22-23
• 1.4 细胞周期与肿瘤23-24
• 1.5 p53在抗癌中的作用24-25
• 1.6 Bax在抗癌中的作用25-26
• 1.7 Bcl-2在抗癌中的作用26-28
• 1.8 中药抗肿瘤的研究现状28-35
• 1.8.1 中药能诱导肿瘤细胞凋亡28-29
• 1.8.2 中药对肿瘤细胞增殖的抑制作用29-30
• 1.8.3 中药能抑制端粒酶活性30-31
• 1.8.4 中药能调控原癌基因和抑癌基因的表达31-32
• 1.8.5 中药能抑制癌细胞的转移和抗侵袭作用32
• 1.8.6 中药对肿瘤细胞分化的诱导32-33
• 1.8.7 中药能调节代谢33
• 1.8.8 中药能逆转肿瘤细胞的耐药性33-34
• 1.8.9 中药对肿瘤内血管生长的抑制34-35
• 1.8.10 中药能减少化疗对机体的副作用35
• 1.9 红花在中药中的作用35-36
• 1.10 红花抗肿瘤作用的研究进展36-37
• 展望37-39
• 第二章 红花多糖的提纯和鉴定39-45
• 引言39
• 1 材料39-40
• 2. 方法40-42
• 3. 结果与分析42-43
• 4. 讨论43-45
• 第三章 红花多糖对人乳腺癌细胞MCF-7凋亡和周期的影响45-72
• 引言45-46
• 1. 材料46-48
• 2. 实验方法48-54
• 3. 实验结果54-68
• 4. 讨论68-70
• 小结70-72
• 第四章 红花多糖对MCF-7细胞Bax、Bcl-2、p53基因和蛋白表达的影响72-89
• 引言72-73
• 1. 材料73-76
• 2. 实验方法76-82
• 3. 数据统计82
• 4. 结果82-86
• 5 讨论86-88
• 小结88-89
• 第五章 红花多糖对人乳腺癌MCF-7裸鼠移植瘤生长的抑制作用89-93
• 引言89
• 1. 材料89-90
• 1.1 细胞系89-90
• 1.2 试验动物90
• 2. 试验方法90
• 2.1 细胞培养90
• 2.2 动物模型建立及分组90
• 2.3 观察指标90
• 3. 统计学方法90
• 4. 结果90-91
• 5. 讨论91-92
• 小结92-93
• 参考文献93-111
• 中英文缩略词111-112
• 致谢112-114
• 统计学证明114

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本文编号：361664