SD大鼠NPMSC和BMSC在体外诱导条件下向软骨细胞分化能力的研究

发布时间：2017-05-13 14:04

  本文关键词：SD大鼠NPMSC和BMSC在体外诱导条件下向软骨细胞分化能力的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着下腰痛的发病率越来越高,治疗这种疾病已经成为当今社会界面临的一个医疗和社会难题。研究发现下腰痛是由许多原因造成的,包括外伤,椎间盘退变,椎间盘突出,椎管狭窄等。而椎间盘退变被认为是下腰痛的主要原因。椎间盘退变表现为:髓核细胞和细胞外基质的减少,椎间盘结构的破坏。许多因素包括:基因、不良生活习惯、重体力劳动和其他的身体机能紊乱等都可能导致椎间盘退变。目前的治疗椎间盘退变方法有:药物治疗、类固醇注射、理疗、椎间盘切除、脊柱融合术等。这些方法只能减轻临床症状,还不能治愈和阻止椎间盘退变的过程。因此,提出来许多新的治疗和逆转椎间盘退变的方法。这些方法集中在修复再生髓核细胞,并取得了一定的研究进展。第一种新疗法是分子治疗,利用基因产物调控合成代谢和降解途径从而抑制或逆转椎间盘退变。第二种新疗法是细胞治疗,结合组织工程技术,通过恢复或更换退变椎间盘中减少和衰老的髓核细胞来达到治疗的目的。目前用到的种子细胞有从骨髓、脂肪、脐带等组织提取出来的干细胞,还有同源性软骨细胞和髓核细胞等。最近Blanco报道从退变椎间盘组织中分离培养出一些细胞,以骨髓间充质干细胞为对照,发现这类细胞表达干细胞表面标志物CD44、CD29、CD90、CD73、CD105、CD166、CD106,不表达造血干细胞标志物CD34、CD45、CD14、CD19,并与骨髓间充质干细胞标志物表达无明显不同,并且具有成骨、成软骨的分化能力,而无成脂分化能力。符合国际细胞治疗学会(the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the International Society for Cellular Therapy,ISCT)中有关多能间充质干细胞的界定标准。从髓核分离的干细胞,来源于髓核组织,相对于其他组织来源的干细胞更能适应椎间盘的内环境。但髓核干细胞和骨髓干细胞在细胞形态、增值能力、成骨成脂成软骨分化能力上有什么区别,还没有相关文献报道。本实验从SD大鼠的髓核组织中提取了髓核干细胞,并进行培养鉴定。比较髓核干细胞和骨髓干细胞形态,增值能力和分化能力。比较髓核干细胞和骨髓干细胞在体外诱导条件下成软骨能力有何区别。本实验共分为三部分:第一部分NPMSC的分离培养鉴定目的:本部分实验从SD大鼠髓核组织中分离和培养髓核干细胞,并通过细胞形态、干细胞基因、干细胞表面标记物,以及成骨、成脂、成软骨分化能力进行鉴定。材料和方法:1.实验动物选用由山西医科大学实验动物中心提供体重250±10g的健康雄性SD大鼠。2.实验方法 2.1 NPMSC分离培养在无菌条件下应用显微镜从每个SD大鼠尾巴的椎间盘内分离髓核组织。经过0.2%II型胶原酶和0.25%胰蛋白酶处理后,用含有20%胎牛血清和青链霉素的DMEM/F12培养基培养。2.2 NPMSC细胞形态观察NPMSC培养到第三代进行细胞形态学观察。2.3 PCR检测NPMSC干细胞基因检测收集第三代NPMSC应用Trizol提取总RNA。PCR检测Nanog、Sox2、Oct-4干细胞基因的表达。2.4 PCR检测NPMSC干细胞表面标记物检测PCR检测CD44、CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、HLA-DR干细胞表面标记物的表达。2.5 NPMSC成骨、成脂、成软骨诱导分化NPMSC在体外诱导条件下向骨、脂肪、软骨分化。观察NPMSC的多向分化能力。结果:1.SD大鼠髓核组织中可以分离培养NPMSC。2.第三代NPMSC形态基本保持一致为纺锤样长梭形。3.NPMSC表达干细胞基因Nanog、Sox2、Oct-4。4.NPMSC表达干细胞表面标记物CD44、CD105、CD73、CD90,不表达造血干细胞表面标记物CD45、CD34、CD14、HLA-DR。5.NPMSC具有成骨、成脂、成软骨多向分化能力。结论一:从SD大鼠的髓核组织中可以分离培养出纺锤样长梭形细胞,表达干细胞基因Nanog、Sox2、Oct-4,表达干细胞表面标记物CD44、CD105、CD73、CD90,不表达造血干细胞表面标记物CD45、CD34、CD14、HLA-DR,具有成骨、成脂、成软骨多向分化能力的NPMSC。第二部分NPMSC和BMSC增殖能力和多向分化能力的比较目的：分离培养SD大鼠NPMSC和BMSC,比较两种干细胞形态、细胞增殖能力、干细胞基因表达、干细胞表面标记物表达、成骨成脂成软骨分化能力,以及诱导后成骨、成脂、成软骨基因的表达。材料和方法:1.实验动物选用由山西医科大学实验动物中心提供体重250±10g的健康雄性SD大鼠。2.实验方法 2.1 NPMSC和BMSC分离培养分别从SD大鼠的椎间盘髓核组织和长骨骨髓中分离培养NPMSC和BMSC。2.2 NPMSC和BMSC细胞形态观察NPMSC、BMSC培养到第三代进行细胞形态学观察。2.3 NPMSC和BMSC细胞增殖能力检测应用CCK-8法分别检测第三代NPMSC和BMSC在第0、1、3、5、7、9天的细胞增殖能力。2.4 PCR检测NPMSC和BMSC干细胞基因检测收集第三代NPMSC、BMSC应用Trizol提取总RNA。PCR检测Nanog、Sox2、Oct-4干细胞基因的表达。2.5 PCR检测NPMSC和BMSC干细胞表面标记物检测PCR检测第三代NPMSC和BMSC中CD44、CD105、CD73、CD90、CD45、CD34、CD14、HLA-DR干细胞表面标记物的表达。2.6 NPMSC和BMSC成骨、成脂、成软骨诱导分化NPMSC、BMSC在体外诱导条件下向骨、脂肪、软骨分化。观察NPMSC、BMSC的多向分化能力。2.7 PCR检测NPMSC和BMSC成骨、成脂、成软骨基因的表达PCR检测NPMSC和BMSC诱导后成骨、成脂、成软骨基因的表达。结果:1.SD大鼠髓核组织和骨髓中分离培养NPMSC和BMSC。2.第三代NPMSC和BMSC形态基本一致均为纺锤样长梭形。3.第三代NPMSC和BMSC在增殖能力上相近。4.NPMSC和BMSC均表达干细胞基因Nanog、Sox2、Oct-4。5.NPMSC和BMSC表达干细胞表面标记物CD44、CD105、CD73、CD90,不表达造血干细胞表面标记物CD45、CD34、CD14、HLA-DR。6.NPMSC和BMSC具有成骨、成脂、成软骨多向分化能力。7.NPMSC和BMSC诱导后均表达成骨、成脂、成软骨基因。结论二:SD大鼠髓核组织中分离培养的NPMSC和长骨骨髓中分离培养的BMSC在细胞学形态、增殖能力上一致,均表达干细胞基因,表达干细胞表面标记物,不表达造血干细胞表面标记物,具有成骨、成脂、成软骨能力,诱导后表达成骨、成脂、成软骨基因。第三部分NPMSC和BMSC成软骨能力的比较目的:应用PCR、RT-PCR、Western-blotting等方法检测NPMSC和BMSC成软骨诱导后II型胶原、蛋白聚糖、SOX9基因和蛋白表达。比较两种干细胞在成软骨能力上的差异。材料和方法:1.实验动物选用由山西医科大学实验动物中心提供体重250±10g的健康雄性SD大鼠。2.实验方法 2.1 NPMSC和BMSC在体外诱导条件下向软骨细胞分化三代干细胞2.5×105个离心后,加入1ml新鲜的完全成软骨诱导液(1ml不完全成软骨诱导液+10μTGF-?3),在成软骨诱导第21 d的时候,收集细胞。2.2 PCR检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9基因的表达分别提取NPMSC和BMSC诱导前后细胞的总RNA,应用PCR检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9基因的表达。2.3 RT-PCR检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9基因的表达分别提取NPMSC和BMSC诱导前后细胞的总RNA,逆转录后应用RT-PCR定量检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9基因的表达。2.4 Western-blotting检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9蛋白的表达分别提取NPMSC和BMSC诱导前后细胞的总蛋白,应用Western-blotting定量检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9蛋白的表达结果:1.NPMSC和BMSC在体外诱导条件下均可以向软骨分化。2.NPMSC和BMSC成软骨诱导后PCR检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9基因表达均增高,两者之间表达无差异。3.NPMSC和BMSC成软骨诱导后RT-PCR定量检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9基因表达均增高,两者之间表达无差异。4.NPMSC和BMSC成软骨诱导后Western-blotting定量检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9蛋白表达均增高,两者之间表达无差异。结论三:NPMSC和BMSC成软骨诱导后,经PCR、RT-PCR、Western-blotting检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9基因和蛋白表达均较诱导前明显增高。NPMSC和BMSC诱导后II型胶原、蛋白聚糖、SOX9基因和蛋白表达无明显差异。NPMSC和BMSC在体外诱导条件下向软骨细胞分化能力无明显区别。结论:通过本次试验证实了SD大鼠椎间盘髓核组织内可以分离培养出具有干细胞特性的髓核干细胞,其次髓核干细胞和骨髓干细胞相比在体外诱导条件下成软骨能力上相似,为组织工程提供了新的种子细胞。
【关键词】：NPMSC(nucleus pulposus mesenchymal stem cells) BMSC(bone marrow mesenchymal stem cells) 增殖能力 多向分化能力
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R681.5
【目录】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-20
• 常用缩写词中英文对照表20-21
• 前言21-23
• 第一部分 NPMSC的分离培养鉴定23-41
• 1 材料与方法24-35
• 1.1 实验动物24
• 1.2 主要试剂和仪器24-26
• 1.3 试验方法26-35
• 2 结果35-39
• 2.1 NPMSC细胞形态观察35
• 2.2 PCR检测NPMSC干细胞基因表达35-36
• 2.3 PCR检测NPMSC干细胞表面标记物36-37
• 2.4 NPMSC成骨、成脂、成软骨诱导分化37-39
• 3 讨论39-41
• 第二部分 NPMSC和BMSC增殖能力和多向分化能力的比较41-64
• 1 材料与方法42-56
• 1.1 实验动物42
• 1.2 主要试剂和仪器42-44
• 1.3 试验方法44-56
• 2 结果56-62
• 2.1 NPMSC、BMSC细胞形态观察56-57
• 2.2 NPMSC、BMSC细胞增殖能力的比较57
• 2.3 PCR检测NPMSC、BMSC干细胞基因表达57-58
• 2.4 PCR检测NPMSC、BMSC干细胞表面标记物58-59
• 2.5 NPMSC、BMSC成骨、成脂、成软骨诱导分化59-60
• 2.6 PCR检测NPMSC、BMSC诱导后成骨、成脂、成软骨基因的表达60-62
• 3 讨论62-64
• 第三部分 NPMSC和BMSC成软骨能力的比较64-85
• 1 材料和方法65-75
• 1.1 研究对象65
• 1.2 主要试剂和仪器65-67
• 1.3 实验方法67-74
• 1.4 统计学方法74-75
• 2 结果75-81
• 2.1 NPMSC和BMSC在体外诱导条件下均可以向软骨分化75
• 2.2 NPMSC和BMSC成软骨诱导后PCR检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9基因表达均增高，两者之间表达无差异75-77
• 2.3 NPMSC和BMSC成软骨诱导后RT-PCR定量检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9基因表达均增高，两者之间表达无差异77-78
• 2.4 NPMSC和BMSC成软骨诱导后Western-blot定量检测II型胶原、蛋白聚糖、SOX9蛋白表达均增高，两者之间表达无差异78-81
• 3 讨论81-84
• 4 结论84-85
• 参考文献85-92
• 综述92-110
• 参考文献100-110
• 致谢110-111
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果111-112
• 个人简历112

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