丙磺舒在全脑缺血复灌损伤中的作用及机制研究

发布时间：2017-05-15 08:10

  本文关键词：丙磺舒在全脑缺血复灌损伤中的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：血管再通治疗(如rtPA溶栓治疗及机械取栓术)仍然是治疗急性缺血性脑血管疾病的唯一有效方法。然而,血管再通大脑恢复灌注过程中可能会导致血脑屏障破坏、钙超载、氧自由基过饱和、严重水肿、出血转化等不良后果,从而加重脑组织损伤,称为脑缺血复灌损伤(cerebral ischemia/reperfusion (I/R) injury)。尽管各国政府投入大量的研究经费,对于脑卒中缺血及复灌损伤病理机制的研究已经取得了重要进展,并开发了一系列的药物或分子蛋白,但向临床应用的有效转化却少有成功。因此,研究阐明脑卒中所致神经损伤的病理机制、寻找新的有效的生物靶点、研发理想的治疗药物显得尤为迫切。2000年Panchin等在脊椎动物体内找到一类基因与无脊椎动物缝隙连接蛋白基因Innexin类似,被称为Pannexin (Panx),其所表达的Panx蛋白包含三种亚型：Panx 1、Panx 2和Panx3.其中Panx1在中枢神经系统中有着非常广泛的表达,而在神经锥体细胞上的表达尤其丰富。随后大量研究表明Panx蛋白可以在细胞膜上形成蛋白通道,介导细胞内ATP释放、细胞间钙波传递、血管血流调节、免疫应答等多种生理功能。病理状态下参与炎症、肿瘤、癫痫及脑缺血等多种疾病发生发展,提示该蛋白通道在人体的一系列生理病理过程中起着非常重要的作用。一系列的离体和在体研究也证实通过药物阻断Panx1通道或敲除Pannexn1基因可以明显改善缺血损伤对离体神经元或脑组织的伤害,减少小鼠局灶性脑缺血所致的梗死面积,并改善其神经功能,提示Panx1通道可能是治疗脑缺血复灌损伤的重要靶点。丙磺舒(Probenecid, PROB)被用于临床治疗痛风已有数十年,最近William Silverman的研究表明丙磺舒也是Panx1通道的特异性阻断剂,体外研究表明其半抑制浓度(IC50)约为150州,即使非常低的浓度(1μM)对Panx1通道也有一定的抑制作用,而1mM浓度的丙磺舒可以完全抑制该通道。以往的研究也发现丙磺舒可以被用来治疗中枢神经系统疾病,如神经退行性疾病(帕金森病、阿尔茨海默病、Huntington病)、癫痫及脑缺血性疾病,认为丙磺舒作为有机阴离子转运体抑制剂,可以抑制中枢神经系统色氨酸降解代谢物(如犬尿酸,kynurenic acid, KYNA)的清除,从而增加其浓度。KYNA是离子型谷氨酸受体内源性竞争性抑制剂,可以与NMDA受体上的甘氨酸位点发生作用,同时还可以抑制a7-烟酰胺乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptors, a7nAChR),从而减轻各种中枢神经系统损伤后的兴奋性毒性损伤。但研究也发现,即使腹腔注射给予200mg/kg的丙磺舒对脑组织内KYNA浓度的提高也非常有限,不足以阻断兴奋性受体NMDARs或a7nAChRs。单独给予50mg/kg或2mg/kg的丙磺舒对脑缺血损伤也具有一定的保护作用,说明丙磺舒的神经保护作用可能不是通过提高内源性神经保护剂,而是通过其他途径而发挥神经保护作用。事实上丙磺舒可以通过血脑屏障进入中枢神经系统,作为Panxl通道阻滞剂可以直接与神经系统发生作用。然而,目前对于丙磺舒的这种直接保护作用的研究尚很缺乏,对于丙磺舒治疗缺血脑损伤的合适给药剂量、途径亦缺乏深入的研究。研究目的：基于以上的研究背景,我们建立了大鼠全脑缺血复灌损伤模型,观察丙磺舒对全脑缺血复灌损伤的可能保护作用,试图解决以下问题：(1)通过不同剂量,不同时间及不同途径给药治疗,明确丙磺舒对全脑缺血复灌损伤的保护作用；(2)探索丙磺舒治疗脑缺血复灌损伤可能的最佳剂量水平,明确丙磺舒给药治疗的合适途径；(3) 探讨丙磺舒治疗脑缺血复灌损伤的可能机制。通过我们的研究,为丙磺舒临床治疗缺血性脑血管疾病提供可靠的理论依据。第一部分丙磺舒对全脑缺血复灌损伤后海马CA1区神经元存活的影响研究方法取体重280-350g的成年雄性SD大鼠。应用四血管法(4-vessel occlusion, 4-VO)建立全脑缺血复灌损伤模型,缺血时间20min。在缺血前、缺血后经静脉、腹腔或灌胃给予不同剂量的丙磺舒治疗,在复灌后7天处死大鼠,进行HE染色观察海马CA1区神经元的死亡情况,比较不同剂量、途径及方法对缺血后神经元死亡保护作用的区别。结果(1)在缺血前10min经静脉给予0.1mg/kg, 1.0mg/kg或10mg/kg对全脑缺血复灌损伤后海马CA1区神经元死亡均有一定的保护作用,其中1mg/kg组保护最明显。(2)缺血后10min和2h腹腔单次注射给药同样具有保护作用,但6h后单次给药无明显保护作用。缺血复灌后2h或6h连续给药1周可以提高丙磺舒对海马CA1神经元的保护作用。(3)缺血前灌胃1周及缺血复灌2h后灌胃1周对缺血后海马神经元损伤均有保护作用。(4)不同途径(静脉、腹腔或灌胃)丙磺舒给药对缺血损伤的保护作用无明显影响。结论：缺血前及缺血后丙磺舒给药对全脑缺血复灌损伤均有一定的保护作用。丙磺舒的保护作用不是剂量依赖的,与缺血后起始给药的时间密切相关,不同途径给药并不影响丙磺舒的疗效。第二部分丙磺舒对全脑缺血复灌损伤保护作用的可能机制研究研究方法在缺血前给予lmg/kg丙磺舒,分别在缺血后24h,48h,72h及7天处死大鼠,取脑或提取海马组织,进行荧光免疫组化检查和western blot检查,观察缺血复灌后大鼠海马区组织蛋白酶Cathepsin B,炎症反应细胞(GFAP,Iba-1)及蛋白Calpain-1,Hsp70的表达变化及丙磺舒的干预作用。同时观察比较缺血后2h及6h单次给药组和连续给药7天组海马区的炎症反应细胞表达变化情况。离体培养新生大鼠海马原代神经元,氧糖剥夺/复氧复糖损伤(OGD/R)后观察丙磺舒对神经元内钙离子浓度的影响。结果(1)缺血复灌损伤后海马区神经元组织蛋白酶Cathepsin B的表达明显增高,提示溶酶体膜的破坏,丙磺舒治疗可以抑制Cathepsin B的表达；(2)丙磺舒可以抑制缺血后Calpain-1的表达,相反可以提高保护性热休克蛋白Hsp70的表达；(3)丙磺舒可以抑制OGD/R后神经元内钙离子浓度的升高；(4)脑缺血复灌损伤后,海马区的炎症反应细胞明显增加,缺血后6h单次给药可以轻度抑制炎性反应细胞的增加,但连续给药7天可以明显抑制海马区炎症反应细胞的增加及活化。结论：丙磺舒可以抑制脑缺血损伤后急性期的钙超载,进而抑制钙蛋白酶Calpain-1的表达,减少溶酶体组织蛋白酶Cathepsin B的释放,同时提高热休克蛋白Hsp70的表达,丙磺舒还可以抑制缺血损伤后中晚期的炎症反应,从而发挥其神经保护作用。
【关键词】：缺血复灌损伤 Pannexin通道 丙磺舒 钙蛋白酶 炎症
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R743
【目录】：

• 致谢5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-15
• 缩略语表15-19
• 引言19-26
• 第一部分 丙磺舒对全脑缺血复灌损伤后海马CA1区神经元存活的影响26-46
• 1.1 前言26-27
• 1.2 实验材料27-29
• 1.3 实验方法29-34
• 1.4 实验结果34-43
• 1.5 讨论43-45
• 1.6 小结45-46
• 第二部分 丙磺舒对全脑缺血复灌损伤保护作用的可能机制研究46-82
• 2.1 前言46-50
• 2.2 实验材料50-57
• 2.3 实验方法57-64
• 2.4 实验结果64-76
• 2.5 讨论76-81
• 2.6 小结81-82
• 总结及展望82-84
• 参考文献84-92
• 综述92-107
• 参考文献102-107
• 作者简历及在读期间所取得的科研成果107-108

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本文编号：367232