乳腺癌中wnt5a的表达及其对wnt经典信号通路调控的研究

发布时间：2017-05-15 14:08

  本文关键词：乳腺癌中wnt5a的表达及其对wnt经典信号通路调控的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Wnt (wingless-type MMTV integration site family)蛋白家族包括至少19个成员,是一组富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白,参与胚胎发育、细胞增殖分化甚至肿瘤发生等多个生物进程。依据其不同功能,wnt信号通路可分为经典通路和非经典通路,其中经典通路具有细胞转化能力,对其研究已较广泛。经典wnts主要通过β-连接素(β-Catenin)/T细胞因子(T cell factor, TCF)介导wnt靶基因的激活,进而调节细胞的分化和增殖,该途径成员有wnt1, wnt2, wnt3, wnt3a, wnt8等;另2条非经典通路为β-Catenin非依赖性的wnt/极性通路和wnt/Ca2+通路,通常不具备细胞转化能力,其成员包括wnt4, wnt5a, wnt5b, wnt7b, wnt11等。Wnt信号途径不仅直接控制着大量生长、代谢相关基因的表达水平,还通过与其它信号通路之间复杂的相互作用间接影响着一系列下游基因的表达。由此,wnt信号转导通路可参与多种生物学过程的调控,包括胚胎生长和形态发育、干细胞功能维持、能量代谢的平衡以及组织稳定,而其失调则常与人类重大疾病相关。正常情况下,胞浆内的β-Catenin与糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase 3, GSK3)、腺瘤性息肉病蛋白(adenomatous polyposis coli, APC)、轴蛋白(Axin)形成复合物后,进入遍在蛋白降解途径,使β-Catenin维持较低水平。Wnt/p-Catenin经典途径中,wnt1、3a等与七次跨膜的卷曲蛋白家族受体(Frizzled, Fzd)及单次跨膜的低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6, LRP5/6)结合,进而募集Dv1、axin-GSK3,后者使LRP5/6磷酸化。磷酸化的LRP5/6可抑制β-Catenin/APC/Axin复合物的形成,β-Catenin不被遍在蛋白降解,则胞浆β-Catenin水平升高,进而入核结合TCF并激活一系列基因的转录,即激活wnt/β-Catenin经典途径。β-Catenin/TCF可介导c-myc、cyclin D1、MMP7等一系列wnt靶基因的激活,进而调节细胞的分化和增殖。Wnt经典途径异常活化已被公认为癌症发生的重要标志,肿瘤细胞的增殖及迁移即常与β-Catenin途径异常激活有关。除wnt蛋白作用外,若APC、 Axin及CTNNB1(编码β-Catenin蛋白)等基因发生突变,亦可阻碍β-Catenin/APC/Axin复合物形成,使P-Catenin稳定性提高,进而激活wnt/β-Catenin信号通路。这些相关基因突变已被证实为人类肿瘤中的常见事件。然而,乳腺癌中这些基因均罕见突变。同时,已有多项研究证实wnt/β-Catenin途径在乳腺癌中亦异常活化,而该途径异常活化的机制则尚未清楚。Wnt5a是wnt非经典途径的重要成员,经与Frz受体结合发挥信号传导作用,参与细胞生长和分化过程中的细胞间信号传递。Wnt5a双突变Wnt-5a-/-鼠胚胎不能存活,且呈断肢、面部畸形等多种发育缺陷,提示其在发育过程中的重要性。然而,由于wnt5a不具备细胞转化能力,对该基因的研究与wnt经典途径成员相比较少,其信号传导途径尚未完全阐明。除wnt/极性通路和wnt/Ca2+通路外,在某些条件下wnt5a也可以通过影响“经典”信号通路而发挥作用,它可通过与不同受体结合,促进或抑制wnt/β-Catenin经典信号通路。Wnt5a在癌症中的作用亦是直到最近才渐渐为人所知。研究指出wnt5a在细胞恶性进展过程中具有关键作用,可因不同肿瘤型别而发挥促进或抑制癌症进展的作用。在前列腺癌、非小细胞肺癌、胰腺癌及皮肤黑色素瘤组织中可检测到wnt5a的高表达,其被认为具有癌基因潜质；而在依赖β-Catenin经典通路活化而实现细胞恶性增殖的肿瘤中,wnt5a可通过抑制β-Catenin经典通路而抑制癌症发生发展。而在急性粒细胞白血病、结直肠癌以及神经母细胞瘤中wnt5a可能发挥生长抑制活性,可以作为肿瘤抑制因子减少或延缓部分恶性肿瘤的发生及其转移,并常因启动子高甲基化而沉默。Wnt5a在乳腺癌中的表达及作用机制仍存在争论。有研究发现wnt5a在非永生性乳腺癌细胞中表达升高,提示其属于促癌基因的一种;亦有研究发现wnt5a在侵袭性乳腺导管癌中表达降低或缺如,并且其低表达与患者的早期复发及不良预后有关,提示其发挥抑制癌症进展的作用。表观遗传学调控异常可使肿瘤相关基因表达异常增高或降低,这在肿瘤的发生发展过程中极为普遍。其中,因启动子甲基化而沉默是肿瘤形成过程中抑癌基因失活的关键机制。几乎所有肿瘤类型中均存在多个抑癌基因由于CpG甲基化而失表达的情况。DNA启动子甲基化可以导致乳腺癌中多种抑癌基因失活,包括细胞周期调控基因、甾体类激素受体基因、细胞侵袭功能相关基因等,是促进乳腺癌发生发展的重要因素。本研究拟明确wnt5a在乳腺癌中的表达情况及调控机制,并探讨乳腺癌中wnt/β-Catenin途径异常活化的可能机制。本研究由两部分组成。第一部分：探讨wnt5a在乳腺癌中的表达情况、表达调控机制,并判断其促癌或抑癌基因属性。收集2008年2月至2009年10月在青岛大学医学院附属医院行乳腺癌根治术或改良根治术患者的新鲜乳腺癌标本及癌旁组织标本136对,采用实时定量RT-PCR技术检测wnt5a在乳腺癌及癌旁组织中的差异表达,并以甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR, MSP)、及亚硫酸盐基因测序(bisulfite genomic sequencing, BGS)法检测其启动子甲基化状态；分析wnt5a表达及其与临床、病理学特征之间的相关性,并对患者随访资料行生存分析,以期明确wnt5a在乳腺癌组织中的表达及调控机制,及其在乳腺癌发生发展中可能发挥的作用。136对乳腺癌及相应癌旁组织的荧光定量PCR检测结果显示,乳腺癌组织中Wnt5a平均表达量仅为癌旁组织的36.35%。乳腺癌中Wnt5a表达与组织学类型及肿瘤大小无关,但随肿瘤组织学等级升高而降低,且有在低龄或淋巴结转移患者中表达更低的倾向。在与其它病理学特征的关系方面,乳腺癌组织中Wnt5a表达量随ER或PR表达升高而呈升高趋势,而与Ki67表达之间则呈负相关。这些数据均支持乳腺癌中wnt5a作为抑癌基因的假设。采用针对wnt5a基因启动子区两个区域的MSP检测结果均显示乳腺癌组织标本中该基因甲基化程度高于相应癌旁组织,同时BGS结果亦显示乳腺癌组织标本中该基因发生甲基化的位点多于癌旁组织标本,提示乳腺癌组织中wnt5a基因表达下调是因启动子甲基化所导致。参考乳腺癌组织较癌旁组织标本中wnt5a的平均相对表达量,将病例按照该相对表达量高低分为3组,采用Kaplan-Meier法进行病例的生存分析,并以log-rank检验比较不同wnt5a表达水平组的生存曲线。Kaplan-Meier分析得出wnt5a低、中、高表达组的5年生存率分别是67.74%(95% CI=48.34-81.36),82.43% (95% CI=68.93-90.45),94.08%(95% CI= 82.74-98.95)= Log-rank检验提示三条曲线间存在显著差异(χ2=9.934,P=0.007),且wnt5a表达与生存时间呈显著线性相关(χ2=9.285,P=0.0023)。第二部分：探讨乳腺癌中wnt/β-Catenin途径异常激活以及wnt5a发挥抑癌作用的分子机制。将外源性wnt5a导入该基因失表达的MCF-7细胞系,并设立失活wnt5a短基因为对照,采用MTT法检测细胞增殖活性,以检测wnt5a对细胞增殖能力的影响;并以western blot检测β-Catenin及下游分子c-myc、cyclin D1、 MMP7的表达情况,以检测外源性wnt5a是否可以抑制wnt/β-Catenin经典通路,进而探讨wnt/β-Catenin途径在乳腺癌中异常激活以及wnt5a发挥抑癌作用的分子机制。乳腺癌细胞系MCF-7给予外源性wnt5a后,MTT细胞增殖活性分析显示转染pcDNA3.1(+)-wnt5a-SI的MCF-7细胞增殖不受影响,而转染pcDNA3.1(+)-wnt5a的MCF-7细胞增殖则有所降低,并在转染后第三、四、五天显著低于未转染组及pcDNA3.1(+)-wnt5a-SI转染组(P0.05)。western blot分析表明wnt5a转染后β-Catenin表达降低,且其下游分子c-myc、cyclin D1、MMP7等表达水平亦下调,提示wnt5a在乳腺癌中可能通过抑制wnt/β-Catenin途径发挥抑癌作用,而wnt/β-Catenin途径的异常活化则与wnt5a甲基化失活有关。本研究得出以下结论：(一)、Wnt5a在乳腺癌中表达下调,且该下调与提示进展型肿瘤类型的各种临床特征具有相关性,支持Wnt5a在乳腺癌中作为肿瘤抑制基因的假设。(二)、表观遗传学机制参与了wnt5a在乳腺癌中的表达调控,其在乳腺癌中表达下调与启动子高甲基化状态有关。(三)、在乳腺癌中wnt5a可能通过抑制wnt/β-Catenin途径而抑制肿瘤细胞增殖及迁移,发挥抑癌作用。(四)、乳腺癌中wnt/β-Catenin途径的异常激活与wnt5a沉默有关。(五)、由于表观遗传学调控具有可逆性,而乳腺癌中wnt/β-Catenin途径的异常激活与wnt5a甲基化沉默有关,故可以借助表观遗传学机制,将wnt信号途径作为乳腺肿瘤的治疗靶点。Wnt/β-Catenin经典途径异常激活是乳腺癌发生发展中的重要事件。本研究证实wnt非经典途径成员wnt5a为乳腺癌的抑癌基因,其在乳腺癌细胞中的甲基化沉默则与该途径的异常活化有关。这一发现为进一步阐明乳腺癌的发生发展机制奠定基础,同时也为乳腺癌的表观遗传学靶向治疗提供有效理论依据。
【关键词】：乳腺肿瘤 表观遗传学 wnt5a β-Catenin 抑癌基因
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-16
• 符号说明16-17
• 第一部分 Wnt5a在乳腺癌中的甲基化失活及其与临床病理学特征关系的研究17-50
• 前言17-20
• 第一章 材料与方法20-30
• 第二章 结果30-38
• 第三章 讨论38-43
• 参考文献43-50
• 第二部分 乳腺癌中wnt5a通过wnt/β-Catenin经典途径发挥抑癌作用50-77
• 前言50-52
• 第一章 材料与方法52-57
• 第二章 结果57-59
• 第三章 讨论59-65
• 参考文献65-77
• 文献综述 乳腺癌表观遗传学研究进展77-93
• 参考文献85-93
• 致谢93-94
• 攻读学位期间发表论文情况94-95
• 论文评阅及答辩情况表95-96
• 外文论文Ⅰ96-112
• 外文论文Ⅱ112-132

【参考文献】

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1 刘霞;Eb病毒相关胃癌肿瘤相关基因表观遗传学调节机制的研究[D];青岛大学;2012年

  本文关键词：乳腺癌中wnt5a的表达及其对wnt经典信号通路调控的研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：367967