用于CHO细胞转录组学分析的内参基因研究及影响Fc融合蛋白产量的潜在基因筛选

发布时间：2022-09-24 21:01

　　生物药从出现至今凭借卓越的疗效、生物科技的快速发展以及研发投入的不断增加,已成为制药行业近年来发展最快的子行业。2019年生物药的全球市场规模已超过3000亿美元,其中抗体类相关药物（完整抗体、Fc融合蛋白、双特异性抗体等）占据了大部分。中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）因具有较理想的翻译后修饰功能,一直是生物药制备的主要表达载体。在已经上市的抗体类药物中约7成都是在CHO细胞中生产的。虽然利用CHO细胞进行抗体类药物制备的产量在过去的几十年有了很大提升,但面对市场规模的不断加大,其产能仍难满足需求,所以提高CHO细胞株的产量具有重要的现实意义。Fc融合蛋白与完整抗体相比,没有轻重链之间的相互作用,在表达机制上必然有所不同,为了了解CHO细胞中与Fc重组蛋白产量相关的部分机制,本研究首先对CHO-K1贴壁细胞进行了无血清全悬浮驯化,然后利用编码有G1p1-Fc融合蛋白的质粒进行转染,通过单克隆筛选获得了 5株具有不同重组蛋白表达水平的CHO细胞,各细胞株的产能经过ELISA及免疫荧光观察的双重确认后对各细胞株进行RNA-seq转录组学测序分析。为使后续的试验结果能够尽量客观地反应胞内的相关... 

【文章页数】：105 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
缩略语表
第一章 前言
    1.1 中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)
        1.1.1 CHO细胞与抗体类药物的生产
        1.1.2 CHO细胞的基因工程改造
    1.2 GLP1-Fc融合蛋白
    1.3 转录组学
    1.4 内参基因
    1.5 RNA干扰(RNAi)技术
    1.6 medag基因
    1.7 本试验的研究目的
第二章 表达GLP1-Fc融合蛋白的CHO-K1细胞株构建
    2.1 试验材料
        2.1.1 细胞株
        2.1.2 培养基
        2.1.3 试剂及耗材
        2.1.4 主要仪器
    2.2 试验方法
        2.2.1 细胞复苏
        2.2.2 贴壁细胞传代
        2.2.3 悬浮细胞传代
        2.2.4 无血清悬浮驯化
        2.2.5 P3.1-GLP1-Fc-GS载体构建
        2.2.6 CHO-K1宿主细胞的转染及单克隆筛选
        2.2.7 ELISA检测Fc融合蛋白浓度
        2.2.8 细胞冻存
        2.2.9 细胞比生产速率的计算
        2.2.10 RNA提取
        2.2.11 反转录
        2.2.12 RT-qPCR
        2.2.13 免疫荧光观察
    2.3 试验结果
        2.3.1 CHO-K1细胞的无血清全悬浮驯化
        2.3.2 P3.1-GLP-1 Fc-GS质粒提取验证结果
        2.3.3 具有不同GLP1-Fc表达量的CHO-K1细胞株筛选
            2.3.3.1 96孔板细胞株产量
            2.3.3.2 24孔板细胞株产量
            2.3.3.3 不同重组蛋白生产率的CHO细胞株的确定及75天传代培养稳定性检测
            2.3.3.4 GLP1-Fc融合蛋白产率及基因拷贝数的测定
            2.3.3.5 免疫荧光法观察重组蛋白分布
    2.4 小结
第三章 表达GLP1-Fc融合蛋白的CHO-K1细胞株的转录组测序分析
    3.1 试验材料
        3.1.1 细胞株
        3.1.2 培养基
        3.1.3 试剂及耗材
        3.1.4 主要仪器
    3.2 试验方法
        3.2.1 RNA提取
        3.2.2 RNA-seq转录组测序分析
    3.3 试验结果
        3.3.1 RNA提取
        3.3.2 转录组测序结果分析
            3.3.2.1 转录组测序质量及基因表达量结果
            3.3.2.2 差异表达基因分析
    3.4 小结
第四章 表达GLP1-Fc融合蛋白的CHO-K1细胞中内参基因的确认
    4.1 试验材料
        4.1.1 细胞株
        4.1.2 培养基
        4.1.3 试剂及耗材
        4.1.4 主要仪器
    4.2 试验方法
        4.2.1 细胞培养
        4.2.2 候选内参基因的确定
        4.2.3 引物设计
        4.2.4 RNA提取及cDNA合成
        4.2.5 RT-qPCR
        4.2.6 内参基因检测结果的统计学分析
    4.3 试验结果
        4.3.1 75天稳定性生长及加料培养生长结果
        4.3.2 候选内参基因的确定
        4.3.3 候选内参基因的引物设计
        4.3.4 候选内参基因的表达水平检测
        4.3.5 geNorm分析
        4.3.6 NormFinder分析
        4.3.7 ACt法分析
        4.3.8 BestKeeper分析
        4.3.9 RefFinder分析
        4.3.10 内参基因的验证
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 RNA干扰法筛选影响Fc融合蛋白产量的潜在基因
    5.1 试验材料
        5.1.1 细胞株
        5.1.2 培养基
        5.1.3 试剂及耗材
        5.1.4 主要仪器
    5.2 试验方法
        5.2.1 待测基因的RT-qPCR验证及引物设计
        5.2.2 RNA提取及cDNA合成
        5.2.3 RT-qPCR
        5.2.4 siRNA的设计
        5.2.5 siRNA干扰试验
        5.2.6 ELISA产量检测
        5.2.7 shRNA质粒的合成
        5.2.8 shRNA质粒的提取、验证及线性化
        5.2.9 转染及稳定株筛选
        5.2.10 稳定株生长参数考察
    5.3 试验结果
        5.3.1 目标基因的RT-qPCR验证
        5.3.2 目标基因的siRNA分子序列
        5.3.3 siRNA干扰试验初筛结果
        5.3.4 siRNA干扰试验结果的复证
        5.3.5 shRNA质粒提取及酶切线性化结果
        5.3.6 稳定株筛选结果
        5.3.7 稳定株生长及生产参数的考察
    5.4 小结
总结
创新点
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文目录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]RNA干扰在生物基因治疗中的应用及意义[J]. 肖倩,孙晓宁.  中南医学科学杂志. 2015(01)
[2]SM22启动SCAP真核表达质粒的构建及其在CHO细胞中的表达[J]. 王媛媛,胡接力,崔静,黄爱龙,阮雄中,陈压西.  生物工程学报. 2010(01)



本文编号：3680860