p38介导结膜松驰症的细胞衰老及杞精明目汤的干预研究

发布时间：2022-12-03 22:51

　　目的:观察p38 MAPK信号通路介导的细胞衰老在结膜松弛症（conjunctivochalasis,CCH）发病中的作用,研究杞精明目汤对p38介导的CCH细胞衰老的保护作用,为CCH发病机制的探索及治疗提供一种新的思路。方法:1.培养CCH结膜成纤维细胞,通过RNA干扰技术构建p38干扰慢病毒载体转染原代分离的CCH成纤维细胞,并用q-PCR和Western blot检测p38α的表达,筛选有效的干扰片段。2.培养CCH和正常人的结膜成纤维细胞,分别用RNA干扰技术和p38抑制剂SB203580处理,分为五组（Control、CCH、CCH+si NC、CCH+siP38、CCH+SB203580）。采用CCK-8检测细胞增殖,β-gal染色检测细胞衰老,流式细胞术检测细胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）,分光光度计比色法检测超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活力,q-PCR及Western blot检测p38α、p53、p21、SMP30的表达。3.培养CCH和正常人的结膜成纤维细胞,分别用杞精明目汤颗粒剂和p38... 

【文章页数】：155 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩略词
引言
第一部分 RNA干扰技术构建p38α干扰慢病毒载体
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 主要试剂
            1.1.2 溶液配制
            1.1.3 主要仪器及耗材
            1.1.4 载体及细胞
        1.2 方法
            1.2.1 标本的采集与保存
            1.2.2 细胞培养和传代
            1.2.3 实验分组
            1.2.4 慢病毒转染技术
            1.2.5 重组干扰慢病毒包装
            1.2.6 实时荧光定量 PCR 检测(Quantitiative Real-time PCR,q-PCR)
            1.2.7 Western blot检测
        1.3 统计学分析
    2 结果
        2.1 RNA干扰质粒的构建
            2.1.1 干扰靶点设计结果
            2.1.2 测序
        2.2 RNA干扰有效靶点的筛选
            2.2.1 RNA干扰后CCH成纤维细胞p38α基因的表达
            2.2.2 RNA干扰后CCH成纤维细胞中p38α蛋白的表达
    3 讨论
    4 小结
第二部分 p38介导结膜松弛症细胞衰老的研究
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 主要试剂
            1.1.2 溶液配制
            1.1.3 主要仪器及耗材
        1.2 实验方法
            1.2.1 标本的采集与保存
            1.2.2 细胞培养和传代
            1.2.3 实验分组
            1.2.4 细胞活性试剂盒(Cell counting kit-8, CCK-8)检测
            1.2.5 β-半乳糖苷酶((β-galactosidase,β-gal)染色
            1.2.6 活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测
            1.2.7 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活力测定
            1.2.8 实时荧光定量PCR检测
            1.2.9 Western blot检测
        1.3 统计学分析
    2 结果
        2.1 结膜成纤维细胞生长情况
        2.2 结膜松弛症中细胞衰老的情况
        2.3 p38对结膜成纤维细胞增殖的影响
        2.4 p38对结膜成纤维细胞ROS的影响
        2.5 p38对结膜成纤维细胞SOD的影响
        2.6 p38对结膜成纤维细胞衰老相关基因表达的影响
        2.7 p38对结膜成纤维细胞衰老相关蛋白表达的影响
    3 讨论
    4 小结
第三部分 杞精明目汤对p38介导的结膜松弛症成纤维细胞衰老的影响
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
            1.1.1 主要试剂
            1.1.2 溶液配制
            1.1.3 主要仪器及耗材
        1.2 实验方法
            1.2.1 标本的采集与保存
            1.2.2 细胞培养和传代
            1.2.3 杞精明目汤颗粒剂的制备
            1.2.4 实验分组
            1.2.5 CCK-8检测
            1.2.6 活性氧(Reactive oxygen species, ROS)含量检测
            1.2.7 超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活力测定
            1.2.8 实时荧光定量PCR检测
            1.2.9 Western blot检测
            1.2.10 质粒构建
            1.2.11 双荧光素酶报告基因检测
        1.3 统计学分析
    2 结果
        2.1 杞精明目汤干预后结膜成纤维细胞的增殖情况
        2.2 杞精明目汤对结膜成纤维细胞ROS的影响
        2.3 杞精明目汤对结膜成纤维细胞SOD的影响
        2.4 杞精明目汤对结膜成纤维细胞衰老相关基因表达的影响
        2.5 杞精明目汤对结膜成纤维细胞衰老相关蛋白表达的影响
        2.6 杞精明目汤对p38启动子活性的影响
    3 讨论
    4 小结
第四部分 杞精明目汤对结膜松弛症细胞衰老的临床研究
    1 资料与方法
        1.1 研究对象
        1.2 结膜松弛症诊断与分级标准
            1.2.1 诊断标准
            1.2.2 临床分级标准
        1.3 病例入选相关标准
            1.3.1 纳入标准
            1.3.2 排除标准
            1.3.3 剔除标准
            1.3.4 病例脱落及处理
        1.4 材料与仪器
            1.4.1 中药方剂和西药
            1.4.2 主要试验材料与仪器
        1.5 治疗方法
        1.6 分组及随机方法
            1.6.1 样本量的估算及其计算的依据
            1.6.2 随机分组方法
            1.6.3 盲法和对照
        1.7 观察指标
            1.7.1 裂隙灯显微镜检查
            1.7.2 国际眼表疾病指数量表(OSDI)
            1.7.3 泪膜破裂时间(BUT)
            1.7.4 基础泪液分泌试验(SIT)
        1.8 手术方法
        1.9 标本处理及细胞衰老染色
            1.9.1 取材与固定
            1.9.2 切片
            1.9.3 冰冻切片细胞衰老染色
        1.10 统计学方法
    2 结果
        2.1 两组CCH患者治疗前后OSDI评分
        2.2 两组CCH患者治疗前后BUT
        2.3 两组CCH患者治疗前后SIT
        2.4 两组CCH患者细胞衰老染色
    3 讨论
    4 小结
创新点
结论
致谢
参考文献
附录一 :文献综述 衰老在祖国医学的认识及其中药研究进展
    参考文献
附录二 :在校期间科研成果
附录三 :参加科研和学术活动
附件


【参考文献】：
期刊论文
[1]黄芪总提取液对D-半乳糖致大鼠亚急性衰老模型的影响研究[J]. 闫晋晋,杨薪正,姚妙,廖国珍.  科技创新与应用. 2018(28)
[2]《本草纲目》对衰老的认识及其防治老年病的思想特点[J]. 薄文集,石和元,王平.  湖北中医药大学学报. 2018(02)
[3]杞精明目汤含药血清对结膜松弛症MAPK信号通路的影响[J]. 贾元玲,项敏泓,黄丽,李青松,文杭,詹月萍.  中国中医眼科杂志. 2018(02)
[4]杞精明目汤颗粒剂对肿瘤坏死因子-α刺激下结膜松弛症成纤维细胞MAPK信号通路的影响[J]. 贾元玲,项敏泓,文杭,李青松,詹月萍,黄丽,刘晓静.  眼科新进展. 2018(04)
[5]黑果枸杞原花青素对小鼠衰老皮肤抗氧化作用及凋亡相关蛋白的影响[J]. 罗文娟,冶娟,马文宇,郭砚,陶丛敏.  山东医药. 2018(10)
[6]灵芝的抗衰老与抗阿尔茨海默病的药理研究进展[J]. 林志彬.  神经药理学报. 2018(01)
[7]基于microRNA-34a/SIRT1/p53通路探讨三七皂苷R1对血管内皮细胞衰老的影响[J]. 赖小华,雷燕,杨静,修成奎.  中国中药杂志. 2018(03)
[8]黄精多糖抗衰老作用及其食品应用研究进展[J]. 衡银雪,刘丹丹,边凤霞,殷钟意,郑旭煦.  重庆工商大学学报(自然科学版). 2017(06)
[9]人参皂苷Rg1基于SIRT6/NF-κB信号通路对辐射致造血干/祖细胞衰老的保护作用[J]. 李渊,周玥,王亚平,何颖红,丁继超,韩艳军,王翠丽.  中草药. 2017(21)
[10]麦冬文献考证[J]. 石开玉.  辽宁中医药大学学报. 2017(10)



本文编号：3707135