STAT5A SNP rs7220367在炎症性肠病中的致病机制及小鼠肠道上皮干细胞Stat5敲除对鼠伤寒沙门氏菌感染的

发布时间：2022-12-09 05:46

　　炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一组不明原因的慢性非特异性肠道炎症性疾病,包括溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis,UC）和克罗恩病（Crohn’s disease,CD）。目前IBD的发病原因和病理生理机制仍未完全明确,其发生可能与肠黏膜组织内固有免疫和获得性免疫应答异常、肠道微生物、肠黏膜屏障损伤、遗传易感性以及环境因素等有关。对IBD患者进行大规模全基因组关联研究,发现了近200个IBD易感基因,除少量位于基因编码区的单核苷酸多态性（Single-Nucleotide Polymorphisms,SNP）位点可直接影响氨基酸序列外,大部分SNP位点的功能和对疾病表型的分子贡献仍不明确。此外,病原微生物感染作为环境触发因素,作用于携带易感基因的个体被认为是IBD的主要发病机制。因此,针对IBD易感基因位点的功能,以及易感基因与环境触发因素相互作用进行研究对解析IBD的发病机制和疾病的诊疗都具有重要意义。Janus激酶/信号转导与转录激活因子（Janus kinase/signal transducer and activat... 

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【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
中英文缩略词
第一部分 STAT5A SNP rs7220367在IBD中的致病机制研究
    前言
    材料和方法
        1. 实验材料
            1.1 实验细胞
            1.2 主要试剂与仪器
            1.3 主要溶液的配制
        2. 实验方法
            2.1 细胞培养及冻存
            2.2 CRISPR/Cas9质粒构建
            2.3 细菌转化
            2.4 质粒小提
            2.5 无内毒素质粒提取
            2.6 质粒转染
            2.7 微量基因组DNA提取及PCR扩增
            2.8 T7E1酶切验证Cas9切割效率
            2.9 克隆挑选
            2.10 突变细胞系筛选和脱靶位点检测
            2.11 总RNA提取
            2.12 转录组测序
            2.13 qRT-PCR实验验证
            2.14 划痕实验
            2.15 Transwell迁移实验
            2.16 EdU染色检测细胞增殖
            2.17 CFSE染色检测细胞增殖
            2.18 生长曲线
            2.19 凋亡检测实验
            2.20 胞浆蛋白和胞核蛋白提取
            2.21 蛋白浓度测定
            2.22 蛋白电泳和免疫印迹
            2.23 免疫荧光检测
        3 统计分析
    结果
        1. 应用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立SNP rs7220367突变细胞系
            1.1 SNPrs7220367基因定位
            1.2 sgRNA和ssODN设计与合成
            1.3 重组真核表达质粒PX458-sgRNA测序鉴定结果
            1.4 sgRNA-PX458转染293T细胞验证切割效率
            1.5 PX458-sgRNA和ssODN共转染HCT116细胞验证耙基因编辑效率和脱靶率
        2. 转录组测序结果
            2.1 总RNA提取及质量检测
            2.2 mRNAs测序原始数据基本情况
            2.3 基因组比对
            2.4 mRNA转录本表达
            2.5 差异表达分析
            2.6 聚类分析
            2.7 功能分析
            2.8 差异表达mRNA的KEGG通路分析
            2.9 IBD相关差异表达mRNA的KEGG通路分析
            2.10 RT-qPCR验证部分差异表达的mRNAs
        3. SNPrs7220367对HCT116细胞迁移能力的影响
            3.1 SNP rs7220367促进HCT116细胞迁移
            3.2 SNP rs7220367抑制细胞刺激因子促进细胞迁移能力
            3.3 Transwell迁移实验结果
        4. HCT116细胞增殖和凋亡实验结果
            4.1 EdU染色检测细胞短期增殖
            4.2 CFSE染色细胞增殖实验结果和Annexin Ⅴ凋亡实验结果
            4.3 HCT116细胞生长曲线
        5. Western Blot检测结果
        6. 免疫荧光检测结果
        7. SNP rs7220367对胚胎干细胞系H9的影响
    讨论
    小结
第二部分 肠道上皮干细胞Stat5敲除对小鼠感染鼠伤寒沙门氏菌的影响研究
    前言
    材料和方法
        1. 实验材料
            1.1 实验动物和菌株
            1.2 实验试剂
            1.3 实验仪器
            1.4 主要试剂配制
        2. 实验方法
            2.1 转基因动物基因型鉴定
            2.2 鼠伤寒沙门氏菌感染实验
            2.3 肠道通透性检测
            2.4 细菌异位检测
            2.5 HE染色
            2.6 免疫组织化学染色
            2.7 免疫荧光染色
            2.8 RT-qPCR检测细胞因子
            2.9 粪便16S测序
            2.10 粪便DNA提取
            2.11 RT-qPCR验证16S测序结果
        3. 统计分析
    结果
        1. Lgr5CreER;:Stat5~(f/f)双转基因小鼠基因型鉴定
        2. 鼠伤寒沙门氏菌感染实验小鼠基本信息
        3. FD4肠道通透性检测结果
        4. 细菌移位检测结果
        5. 肠道炎症病理评分
        6. 免疫组化和免疫荧光检测结果
        7. 炎症因子检测结果
        8. 粪便样本16S测序结果
        9. qPCR验证结果
    讨论
    小结
参考文献
文献综述
    参考文献
个人简历
致谢



本文编号：3714950