EGFR调控PD-L1稳定性及PD-1/PD-L1相互作用介导的肿瘤免疫反应的机制和功能研究

发布时间：2022-12-10 01:06

　　恶性肿瘤是威胁人类健康和生命的主要疾病之一,除传统的手术及放化疗外,利用肿瘤免疫疗法激发T细胞的杀伤活性来控制肿瘤生长已成为临床治疗中不可或缺的手段之一。T细胞可及时识别并清除体内异物或癌变细胞,在抗肿瘤免疫反应中发挥重要功能。T细胞活化需要两个信号的协同作用,除了 T细胞受体（TCR）与抗原肽-MHC分子复合物结合产生的第一刺激信号外,还需要T细胞表面的协同刺激分子提供第二刺激信号。免疫检查点是免疫系统中起抑制作用的第二刺激信号分子,可抑制T细胞的活性,避免引起过激的免疫反应,在机体免疫应答过程中发挥关键调节作用。PD-1（Programmed Death 1）,又称程序性死亡受体-1,是目前研究较为成熟的免疫检查点分子,属于免疫球蛋白超家族,主要表达于T细胞表面。PD-1的配体为PD-L1（Programmed Death-Ligand 1）,又称程序性死亡配体-1。PD-L1存在不同的糖基化修饰形式,主要表达于抗原提呈细胞（APC）或肿瘤细胞表面。PD-1与PD-L1的胞外相互作用可抑制T细胞杀伤反应,导致肿瘤细胞免疫逃逸,近年来PD-1/PD-L1已成为临床上治疗不同类型癌症的... 

【文章页数】：163 页

【学位级别】：博士

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致谢
中文摘要
Abstract
缩略词表
第一章 引言
第二章 实验材料
    2.1 主要仪器
    2.2 主要试剂
    2.3 主要耗材
    2.4 细菌株
    2.5 细胞系
    2.6 质粒
第三章 实验方法
    3.1 细胞处理
    3.2 蛋白质免疫印迹(Western blot)
    3.3 蛋白质斑点印迹(Dotblot)
    3.4 免疫共沉淀(Co-IP)
    3.5 邻位连接技术(Duolink PLA)
    3.6 细胞膜蛋白提取
    3.7 常规质粒构建
    3.8 基因敲低质粒构建
    3.9 体外激酶实验
    3.10 小鼠腹腔巨噬细胞(PDM)的提取
    3.11 小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的提取
    3.12 药物体内抗肿瘤疗效检测
第四章 结果和讨论
    4.1 PD-L1膜蛋白药物筛选模型的建立以及效果验证
        4.1.1 确定糖基化PD-L1膜蛋白为高通量筛选目标蛋白
        4.1.2 PD-L1膜蛋白药物筛选模型的建立
        4.1.3 PD-L1膜蛋白药物筛选模型的可行性检测
        4.1.4 PD-L1膜蛋白药物筛选结果
        4.1.5 筛选药物负向调控PD-L1膜蛋白水平以及PD-1/PD-L1相互作用
    4.2 EGFR调控PD-L1膜蛋白降解以及与PD-1的相互作用
        4.2.1 EGFR抑制剂降低H1975细胞PD-L1膜蛋白水平
        4.2.2 EGFR抑制剂增强H1975细胞PD-L1膜蛋白降解
        4.2.3 EGFR正向调控PD-L1膜蛋白水平
        4.2.4 ES-072相较于AZD9291的优势
        4.2.5 ES-072主要通过EGFR信号通路增强对PD-L1膜蛋白的降解
    4.3 S279/S283磷酸化调控PD-L1膜蛋白降解以及与PD-1的相互作用
        4.3.1 PD-L1膜蛋白降解依赖于磷酸化
        4.3.2 质谱鉴定PD-L1膜蛋白磷酸化位点
        4.3.3 ES-072介导的PD-L1膜蛋白降解依赖其胞内段S279/S283磷酸化
        4.3.4 S279/S283调控PD-L1膜蛋白与K48泛素的相互作用
        4.3.5 S279/S283调控PD-L1膜蛋白和PD-1之间的相互作用
    4.4 PD-L1膜蛋白是GSK3α的直接磷酸化底物
        4.4.1 GSK3β并非糖基化PD-L1膜蛋白的激酶
        4.4.2 GSK3α可能为糖基化PD-L1膜蛋白的激酶
        4.4.3 GSK3α与糖基化PD-L1以及非糖基化PD-L1都存在相互作用
        4.4.4 p-PD-L1(S279)抗体的功能验证
        4.4.5 GSK3α直接磷酸化PD-L1膜蛋白,作用位点为S279/S283
        4.4.6 GSK3α负向调控PD-L1膜蛋白水平
        4.4.7 GSK3α负向调控PD-L1膜蛋白和PD-1之间的相互作用
    4.5 ES-072体内抗肿瘤效果
        4.5.1 EGFR抑制剂降低TAM中PD-L1膜蛋白水平
        4.5.2 ES-072有效控制小鼠体内肿瘤生长
        4.5.3 ES-072有效控制人体内肿瘤生长
    4.6 本研究阐述的模型
    4.7 总结和讨论
参考文献(References)
附录1 常用缓冲液及培养基配方
附录2 质粒克隆所用引物
附录3 siRNA序列
第五章 综述 免疫检查点阻断法治疗肺癌:当前局势和未来展望
    参考文献(References)
作者简历及博士期间科研成果


【参考文献】：
期刊论文
[1]非小细胞肺癌的免疫治疗现状[J]. 田林晓,李小光.  中外医疗. 2015(31)



本文编号：3715744