糖尿病来源的骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的相关研究

发布时间：2017-05-17 02:02

  本文关键词：糖尿病来源的骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的相关研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:骨髓间充质干细胞(MSC)治疗心肌梗死(MI)是MI治疗可选择的治疗手段之一,MSC可以通过旁分泌机制分泌多种细胞因子,发挥其抑制凋亡、促进血管新生、调节心室重塑、改善心脏功能的作用。与MSC移植治疗MI的动物实验不同,其临床试验的效果并不确切。其原因可能是临床患者常合并其他疾病,如糖尿病等。目前关于糖尿病人的MSC的生物学特性及其基因表达差异尚无报道。本研究的目的是比较糖尿病来源与非糖尿病来源的MSC在基因表达方面存在的差异,及其在治疗心肌梗死方面的差异,发现可能引起这些差异的关键细胞因子(Bcl-2、Bcl-x L),并验证通过MSC修饰Bcl-x L是否可以增加MSC的存活率、改善心脏功能。方法:本实验通过Affymetrix全基因组基因芯片技术进行MSC功能基因表达谱分析,以期发现冠心病合并糖尿病(CAD+DM)患者与冠心病非糖尿病(CAD)患者MSC基因表达的差异。并通过慢病毒转染基因修饰MSC的方式研究h Bcl-x L在增加MSC在心肌梗死区域存活率、促进血管新生、抑制凋亡、改善心脏功能等方面的作用。主要内容包括三部分:1、冠状动脉旁路移植(CABG)术中获取患者骨髓,体外扩增MSC,收集第3代细胞进行流式细胞仪筛选鉴定、绘制生长曲线、提取RNA制作基因芯片、比较基因表达差异。2、CAD+DM与CAD患者MSC移植到大鼠心肌梗死区域,观察其对于心肌梗死的治疗作用(抑制凋亡、改善心脏功能),以及Bcl-2、VEGF等表达情况。3、应用慢病毒载体转染系统转染h Bcl-XL-IRES2-EGFP融合基因达到过表达,同时单独转IRES2-EGFP作为对照。通过荧光显微镜、WB方法验证病毒转染效率;流式细胞技术测定是否增强细胞抗凋亡的能力、ELISA测定MSC在低氧培养基上清中细胞因子变化,确定基因修饰后细胞分泌功能的变化。进而进行治疗心肌梗死的动物实验,观察是否能够提高MSC在梗死区的存活率、抑制梗死区域的细胞凋亡、减少瘢痕形成、促进血管新生、改善心脏功能。结果:1、糖尿病患者来源的MSC具有MSC的生物学特性:表达CD29、CD44;不表达CD34、CD45,体外培养发现其增殖能力显著低于非糖尿病患者来源的MSC;2、Affymetrix基因芯片证实:CAD+DM组与CAD组MSC相比较,功能蛋白表达基因中涉及细胞凋亡、细胞因子、细胞内信号传导系统的基因有27个,其中13个基因表达明显上调,分别为TNFRSF10B、TNFRSF21、NGF、CAV2、ITGA8、TNS1、ITGA2、AKT3、MBP、MAP2、INHBA、FST、PLA2G5;有14个基因表达明显下调EPR1、BIRC5HELLS、BCL2、HGF、CASP1、SEPP1、ITGA9、MAP2K6RUNX3、TGFBR2、RUNX2、CTNNB1、CDC42。3、CAD+DM组与CAD组MSC细胞移植到大鼠心肌梗死边缘区均能显著抑制心肌细胞凋亡、改善心脏收缩功能,但CAD+DM组这些作用与CAD组相比显著降低,可能与CAD+DM组移植后Bcl-2表达显著低于CAD组有关。4、慢病毒可以安全、有效的转染h Bcl-x L-IRES-EGFP融合基因、IRES-EGFP融合基因到MSC内,EGFP的共转染可以确定转染效率并测定后续动物实验中MSC的存活率。研究显示,病毒转染未影响MSC的生物学特性,过表达h Bcl-x L可以增加MSC分泌细胞因子和抗凋亡能力,Western Blot检测、Annexin V/PI检测、ELISA检测显示,h Bcl-x L基因修饰的MSC表达h Bcl-x L显著增加、抗凋亡能力增强、分泌VEGF、IGF-1、PDGF等细胞因子增加(p0.05)。5、h Bcl-x L基因修饰的MSC移植治疗心肌梗死的在体实验提示:过表达h Bcl-x L的MSC在移植区域的存活率提高、可以显著降低梗死边缘区心肌细胞凋亡、促进毛细血管新生、减少瘢痕组织形成、改善心脏功能(p0.05)。结论:1、糖尿病来源的MSC在细胞增殖等方面与非糖尿病来源的MSC存在显著差异,两者存在基因表达差异,其Bcl-2表达显著降低;2、糖尿病来源的MSC治疗大鼠心肌梗死疗效与非糖尿病来源的MSC相比显著降低;3、应用慢病毒转染系统转染使MSC高表达Bcl-x L后可以显著提高MSC在低氧条件下的抗凋亡能力、显著增加VEGF、IGF-1、PDGF等细胞因子的分泌。4、高表达Bcl-x L的MSC移植到心肌梗死区域可以显著提高MSC的存活率、抑制细胞凋亡、促进血管新生、抑制瘢痕形成、改善心脏功能。
【关键词】：冠心病 心肌梗死 骨髓间充质干细胞 细胞因子
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.22
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-24
• 一、骨髓间充质干细胞（MSC）的生物学特性及分离纯化16-18
• 二、MSC 治疗心肌梗死的研究现状18-22
• 三、存在问题和解决办法22-23
• 四、MSC 治疗心肌梗死展望23-24
• 第一部分 糖尿病与非糖尿病患者骨髓间充质干细胞基因表达差异分析24-43
• 1 材料24-27
• 2 方法27-35
• 2.1 MSC的获取、分离、培养27-28
• 2.2 MSC生长曲线的绘制28
• 2.3 MSC的形态学和表型鉴定28
• 2.4 基因芯片检测MSC基因表达28-34
• 2.5 基因表达差异在蛋白水平的验证34-35
• 2.6 统计学处理35
• 3 结果35-41
• 3.1 MSC的培养和观察35-37
• 3.2 MSC表面标志物鉴定37
• 3.3 基因芯片待测RNA质量控制情况37-38
• 3.4 基因表达谱差异情况38-40
• 3.5 差异基因表达在蛋白水平的验证40-41
• 4 讨论41-43
• 第二部分 糖尿病与非糖尿病的冠心病患者骨髓间充质干细胞治疗大鼠心肌梗死疗效比较43-54
• 1 材料43-44
• 2 方法44-48
• 2.1 病例资料与细胞培养44
• 2.2 大鼠心肌梗死模型的制作44-45
• 2.3 骨髓间充干细胞移植45
• 2.4 超声心动图检测45
• 2.5 心肌细胞凋亡检测45-46
• 2.6 心肌组织蛋白印迹检测46-47
• 2.7 免疫组化检测47-48
• 2.8 统计学方法48
• 3 结果48-51
• 3.1 大鼠心肌梗死模型的建立48-49
• 3.2 超声心动图结果49-50
• 3.3 心肌细胞凋亡检测情况50
• 3.4 心肌组织蛋白表达情况50-51
• 4 讨论51-54
• 第三部分 Bcl-x L基因修饰对MSC治疗心肌梗死的疗效影响54-80
• 1 材料55-57
• 2 方法57-65
• 2.1 慢病毒包装57-59
• 2.2 细胞转导59-61
• 2.3 细胞成像61
• 2.4 免疫表型鉴定61
• 2.5 Annexin V/PI方法检测低氧条件下MSC凋亡情况61-62
• 2.6 体外培养MSC分泌细胞因子的检测62-63
• 2.7 心肌梗死模型建立和骨髓间充质干细胞移植63
• 2.8 移植细胞存活率测定63-64
• 2.9 细胞移植后心肌细胞凋亡情况分析64
• 2.10 毛细血管密度测定64
• 2.11 瘢痕形成情况检测64-65
• 2.12 MSC移植后心脏功能评估65
• 2.13 统计学分析65
• 3 结果65-77
• 3.1 增强型绿色荧光蛋白和人Bcl-x L在基因修饰的大鼠骨髓基质干细胞内的表达65-69
• 3.2 基因修饰的大鼠MSC的免疫表型特征69-70
• 3.3 Bcl-x L修饰抑制MSC的体外凋亡70-71
• 3.4 Bcl-x L修饰促进MSC内血管生成细胞因子的分泌71-72
• 3.5 Bcl-x L修饰促进MSC在缺血心肌中的存活72-74
• 3.6 h Bcl-x L修饰的MSC可增强心肌细胞抗凋亡能力74-75
• 3.7 Bcl-x L修饰的MSC促进心肌梗死后的血管新生和预防瘢痕形成75
• 3.8 Bcl-x L修饰的MSC可促进MI后心脏功能的恢复75-77
• 4 讨论77-80
• 结论80-81
• 参考文献81-97
• 个人简历和研究成果97-98
• 致谢98

  本文关键词：糖尿病来源的骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的相关研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：372304