CGI-58基因调控脂代谢介导卵巢癌细胞侵袭转移的作用及机制研究

发布时间：2017-05-17 03:06

  本文关键词：CGI-58基因调控脂代谢介导卵巢癌细胞侵袭转移的作用及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：背景:恶性肿瘤细胞代谢重编程是其生物学特点之一,其中脂代谢重编程对细胞的生长、增殖和侵袭转移力的改变具有重要作用。脂肪既是细胞能量的来源,也是构成细胞的成分。脂肪代谢过程涉及到多种酶,这些酶的活性改变不仅会影响肿瘤脂代谢,也会影响肿瘤细胞的生物学特性。在脂代谢相关酶中,辅酶CGI-58是甘油三酯水解酶(ATGL)的辅助激活因子,协助将甘油三酯水解为游离脂肪酸和甘油二酯。CGI-58基因被敲除后不仅会改变肿瘤细胞的代谢,在我们的研究中还发现可以改变肿瘤细胞的生物学特性尤其是侵袭力。我们之前的研究证实肿瘤细胞的CGI-58基因表达和肿瘤的恶性程度及侵袭力有相关性,但是如果通过慢病毒转染shRNA敲除CGI-58后发现,不同细胞侵袭力的变化是有差别的,其中以结肠癌细胞HCT-116和卵巢癌细胞SKOV3的侵袭力变化差异最为明显:前者发生了促进侵袭转移的上皮-间质转化(EMT),后者发生的则是抑制侵袭转移的间质-上皮转化(MET)。同一基因的敲除在不同的肿瘤细胞中带来完全相反的结果,为了探寻肿瘤细胞在CGI-58基因调控的脂代谢介导卵巢癌细胞发生EMT-MET变化的机制,同时了解CGI-58基因在临床卵巢癌标本中表达的情况,以及它和卵巢癌临床病理之间的关系,我们设计了本课题并加以验证。目的:1.构建卵巢癌细胞的CGI-58基因敲除模型;检测CGI-58敲除的SKOV3细胞发生的代谢变化;2.观察卵巢癌细胞SKOV3失去CGI-58表达对侵袭转移力的影响,通过一系列回复实验,探讨影响CGI-58敲除后肿瘤细胞发生EMT-MET的关键分子及相关信号通路,以及相关的作用机制;3.检测CGI-58在卵巢癌临床标本中的表达水平;分析CGI-58的表达和临床病理参数之间的意义。材料与方法:1.材料:卵巢癌细胞SKOV3,OVCAR3,结肠癌细胞HCT-116(分含有野生型p53及不含p53两种),手术切除的临床卵巢癌标本;cgi-58shrna质粒,β-catenin和p53过表达质粒;慢病毒包装试剂,细胞培养试剂,免疫组化/免疫荧光染色试剂、westernblot试剂、各种生化试剂等。2.方法:cgi-58敲除细胞系、β-catenin过表达细胞系和p53过表达细胞系通过质粒转导方法转染细胞,并使用药物筛选建立稳定表达细胞系;蛋白表达水平和分布位置通过westernblot和免疫荧光染色检测;细胞脂肪滴和线粒体活性使用荧光染色剂染色观察其荧光强度;甘油三酯和游离甘油含量检测,细胞活性氧(ros)含量检测使用光密度比色法;细胞生长和增殖力检测使用cck8和克隆形成实验;细胞侵袭转移力检测使用划痕实验和transwell实验;细胞自噬通过去除血清法,脂解功能通过激素刺激法,其中的蛋白和甘油三酯/游离甘油含量检测使用wb和比色法;组织芯片使用免疫组化染色,评分分值为染色面积和强度两部分之和组成。结果:1.慢病毒敲除cgi-58基因表达后,卵巢癌细胞skov3在细胞浆中出现大量脂肪滴,活细胞荧光染色可见到脂滴的绿色荧光,细胞甘油三酯含量测定显示敲除细胞内甘油三酯水平明显高于非敲除细胞。脂解实验结果:skov3细胞内脂肪水解酶hsl不受cgi-58基因表达减少影响,可在外源性激素的作用下水解部分甘油三酯,但是skov3细胞甘油三酯合成能力强,在脂解作用发生时可以迅速从非脂类物质合成代偿甘油三酯的损失。2.wb检测糖\脂代谢的相关酶类发现:和对照组细胞相比,cgi-58敲除细胞中负责调节atp:amp比例的酶ampkα,磷酸化水平上升,脂肪酸合成相关酶acc和氧化磷酸化相关酶akt的磷酸化水平无变化,抑制糖原合成的gsk-3β酶磷酸化水平降低;活细胞线粒体染色显示cgi-58敲除细胞的线粒体呼吸和氧化功能弱于非敲除细胞,在ros实验中敲除细胞的od-时间曲线斜率高于非敲除细胞,提示细胞内有ros物质堆积。3.cgi-58敲除后,cck8实验结果中敲除细胞生长曲线斜率和非敲除细胞相比,呈下降的局势,在细胞克隆形成实验中,敲除细胞在相同数量相同时间相同条件下培养,最后形成的克隆斑面积明显少于非敲除细胞。4.观察细胞的形态,wb检测cgi-58敲除的skov3细胞上皮和间质性的标记物,发现在cgi-58敲除细胞中上皮标志物e-cad水平上调,间质标记物n-cad、vimentin和slug水平下调,细胞形态由间质型向上皮型转化。同时划痕实验和transwell实验的结果也提示敲除细胞在侵袭、转移等诸多方面的能力都要低于非敲除细胞。5.自噬相关实验结果:敲除CGI-58的细胞的自噬标记物LC3的表达水平高于非敲除细胞,说明CGI-58敲除后细胞自噬水平上升;当使用LC3抑制剂3-MA抑制自噬后,LC3表达水平下降后,敲除和非敲除细胞之间E-cad的水平差异无变化。6.在卵巢癌细胞中,有p53表达的OVCAR3和无p53表达的SKOV3细胞在CGI-58敲除后,E-cad的改变是不同的;而当分别改变SKOV3细胞和HCT-116细胞中p53的状态,将HCT-116细胞的p53沉默,在失去p53表达后,再敲除CGI-58不会引起E-cad表达水平降低;而将p53过表达质粒导入敲除CGI-58的SKOV3细胞中,E-cad表达则会下降。7.CGI-58敲除后,SKOV3细胞β-catenin和Wnt-5a/b信号水平下降,把β-catenin过表达质粒通过慢病毒整合到CGI-58敲除细胞的染色体上,WB检测显示,在β-catenin过表达质粒整合入染色体并发挥作用后,其上皮标志物E-cad下降而N-cad上升。细胞形态上又从上皮型向间质型回复。8.组织芯片免疫组化染色评分结果显示:卵巢癌组织中CGI-58表达呈阳性(强阳性)的占标本总数的85.4%,其表达水平和患者年龄、淋巴结侵犯、远端转移及临床分期等病理参数无关,只和肿瘤的浸润深度及范围具有相关性。结论:1.CGI-58在卵巢癌细胞SKOV3甘油三酯分解中具有重要作用:CGI-58缺失导致细胞内甘油三酯异常积聚,ATP生成减少,同时还削弱细胞线粒体的呼吸氧化功能,引起细胞内的脂代谢重编程,改变了SKOV3细胞的代谢模式。2.CGI-58敲除后引起的代谢重编程导致SKOV3细胞生长增殖受到抑制,自噬水平提升,最主要的变化是细胞的侵袭转移力下降,使得在其形态上发生MET变化。3.CGI-58敲除后导致肿瘤细胞发生EMT/MET改变,依赖于肿瘤细胞p53的状态,p53的状态改变可以决定细胞失去CGI-58后发生EMT还是MET。4.CGI-58表达水平和临床卵巢癌浸润深度和范围相关联,CGI-58的表达水平反映了卵巢癌在局部侵袭力的强弱,有可能成为卵巢癌临床预后的指标之一。
【关键词】：卵巢癌 CGI-58 p53 代谢重编程 上皮-间质转化
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.31
【目录】：

• 缩略语表5-8
• 英文摘要8-12
• 中文摘要12-15
• 第一章 前言15-19
• 第二章 卵巢癌细胞SKOV3 CGI-58敲除后对细胞脂代谢和线粒体功能的影响19-37
• 2.1 研究背景19-20
• 2.2 材料与方法20-29
• 2.3 结果29-34
• 2.4 讨论34-36
• 2.5 小结36-37
• 第三章 CGI-58敲除的SKOV3细胞生物学特性的改变37-51
• 3.1 研究背景37-39
• 3.2 材料与方法39-44
• 3.3 结果44-48
• 3.4 讨论48-50
• 3.5 小结50-51
• 第四章 CGI-58基因敲除的SKOV3细胞发生MET的机制探讨51-67
• 4.1 研究背景51-53
• 4.2 材料和方法53-59
• 4.3 结果59-63
• 4.4 讨论63-66
• 4.5 小结66-67
• 第五章 CGI-58表达水平和卵巢癌临床转移的统计分析67-75
• 5.1 研究背景67-68
• 5.2 材料和方法68-70
• 5.3 结果70-72
• 5.4 讨论72-74
• 5.5 小结74-75
• 全文总结75-76
• 参考文献76-81
• 文献综述一 肿瘤细胞甘油三酯代谢和上皮-间质转化的关系81-87
• 参考文献85-87
• 文献综述二P53调控肿瘤细胞糖/脂代谢的机制87-93
• 参考文献91-93
• 在读期间发表论文93-94
• 致谢94

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 易梅;向波;李小玲;李桂源;;代谢重编程:肿瘤的平衡之舞[J];中南大学学报(医学版);2013年11期

  本文关键词：CGI-58基因调控脂代谢介导卵巢癌细胞侵袭转移的作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：372409