硫化氢通过miR-1-Bcl-2通路抑制缺血再灌注心肌细胞调亡的实验研究

发布时间：2017-05-17 12:27

  本文关键词：硫化氢通过miR-1-Bcl-2通路抑制缺血再灌注心肌细胞调亡的实验研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：缺血再灌注(ischemia reperfusion, IR)损伤所导致的心肌细胞凋亡,是影响缺血心肌组织恢复血液供应后心脏功能恢复的重要因素之一。如何减少包括凋亡在内的细胞死亡,保护心脏功能,目前仍然是心血管领域临床相关科室主要研究的热点之一。晚近研究发现,新型气体信号分子硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)对IR损伤心肌具有重要内源性保护作用,它可以抑制细胞凋亡,发挥心肌保护作用,但具体机制不清。H2S可以通过调节相关微小RNA (microRNA, miRNA, miR)的表达影响肿瘤细胞的生长和凋亡,还可以通过影响miR-133a的表达,抑制心肌细胞肥大。研究证实,miRNA参与调控了包括心肌细胞凋亡在内的多种生理和病理过程。我们推测,某些心肌特异性高表达的niRNA是否参与了H2S对心肌IR损伤的保护,特别是在转录后水平调控某些重要凋亡相关靶基因的表达,从而抑制心肌细胞过度凋亡,保护心脏功能。第一部分H2S调节IR心肌细胞凋亡的在体实验研究一、研究目的评价H2S预处理对在体IR心肌的作用,并筛选H2S组与IR组之间表达差异显著的miRNA.二、研究方法建立SD大鼠心肌IR损伤在体模型,并通过腹腔注射给予不同浓度(10、30、50、100 μM/kg) NaHS(H2S的供体)预处理。采用伊文氏蓝和TTC双染色法检测大鼠心肌梗死面积,全自动化学法检测大鼠血清中LDH漏出量,TUNEL染色法检测心肌细胞凋亡率,RT-PCR, Western blot法检测抑凋亡关键基因Bcl-2的表达。采用miRNA芯片技术,筛选出在IR组和NaHS处理组之间差异显著的miRNA,并用RT-PCR法进行验证。三、结果1、IR组心肌梗死面积明显高于假手术组(Sham组),而给予NaHS预处理,可减小心肌梗死面积,且与浓度密切相关,NaHS为30μM/kg时减小最为明显。2、IR组的LDH漏出量较Sham组明显上升,而给予NaHS预处理可以减少LDH漏出量,与浓度相关,30 μM/kg时改善最为明显。3、与Sham组相比,IR组心肌细胞凋亡率明显增高,给予不同浓度NaHS预处理后,细胞凋亡率减少,且与浓度相关,尤其以30μM/kg时减少最为明显。4、与Sham组相比,IR组Bcl-2的mRNA、蛋白表达均显著降低。NaHS处理各组Bcl-2的表达较IR组上调,且与浓度相关,尤其在30 μM/kg时其上调作用最为显著。5、miRNA基因芯片筛选结果表明,NaHS组的miR-1表达较IR组显著下调。四、结论1、H2S预处理对IR心肌具有明确的心肌保护作用,能抑制心肌细胞过度凋亡,并且这种作用与浓度密切相关,在30 μM/kg时保护作用最为显著。2、H2S组与IR组表达差异显著的miRNA包括miR-1,提示miR-1可能参与了H2S的心肌保护作用。第二部分MiR-1参与H2S影响心肌细胞凋亡的研究一、研究目的评价H2S预处理对离体缺氧复氧(HR)心肌细胞的作用,并探讨miR-1是否参与H2S的影响心肌细胞凋亡的作用。二、研究方法建立原代心肌细胞HR损伤模型,并给予不同浓度(10、30、50、100 μM) NaHS预处理。采用MMT法检测离体心肌细胞的活力,全自动生化分析仪检测细胞培养上清液LDH漏出量,流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率,RT-PCR、Western blot法检测Bcl-2、miR-1的表达。将心肌细胞转染miR-1模拟剂(mimic)上调miR-1的含量,再给予NaHS预处理、HR损伤,通过检测心肌细胞凋亡率,明确miR-1是否参与H2S的抑凋亡作用。三、结果1、HR组细胞活力较对照组(Con组)明显下降,而NaHS预处理各组细胞的活力较HR组明显增高,且与浓度相关,其中30μM组增加最为显著。2、HR组细胞LDH漏出量较Con组明显下降,而NaHS预处理各组细胞的LDH漏出量较HR组明显增高,且与浓度相关,其中30μM组改善最为显著。3、HR组的细胞凋亡率明显高于Con组,而NaHS预处理的细胞较HR组凋亡率有所下降,与浓度相关,其中30μM组下降最为明显。4、与Con组相比,HR组Bcl-2的mRNA、蛋白表达均显著降低；而NaHS预处理各组的Bcl-2的表达量上调,且与浓度相关,在浓度为30μM时Bcl-2的上调最为明显。5、同Con组相比,HR组miR-1表达量显著升高；而NaHS预处理各组miR-1的表达量较HR组有所下降,与浓度相关,在30μM时,miR-1的下调最为显著。6、心肌细胞凋亡率检测结果表明：阴性对照(NC)组与NC+H2S组无显著差异。与NC组相比,mimic组细胞凋亡率显著增加；与HR+NC组相比,HR+mimic组细胞凋亡率增加显著。提示上调miR-1的含量可增加心肌细胞凋亡。与HR+NC+H2S组相比,转染mimic片段的]mimic组的细胞凋亡率明显增加。表明同为接受HR处理,由于转染mimic上调miR-1的含量,即使给予H2S预处理,也不能显著减少心肌细胞凋亡率。四、结论1、在离体细胞水平,H2S具有明确心肌细胞保护作用,30μM浓度保护作用最为显著。2、MiR-1参与了H2S抑制心肌细胞凋亡的过程,上调其表达可以削弱H2S的部分保护作用。第三部分H2S调控miR-1-Bcl-2影响心肌细胞凋亡的实验研究一、研究目的明确miR-1参与H2S心肌保护作用的可能机制。二、研究方法通过Γargetscan、miR-base等生物信息学网站计算、查询和预测,miR-1的潜在靶基因包括抑凋亡关键基因Bcl-2。将离体培养的心肌细胞分别转染不同浓度的miR-1模拟剂(mimic)和拮抗剂(AMO-1),通过检测Bcl-2的蛋白表达水平,研究miR-1是否调控Bcl-2的表达。将心肌细胞转染Bcl-2干扰片段(siRNA),以下调Bcl-2的含量,再给予NaHS预处理、HR损伤,通过检测细胞凋亡率,明确Bcl-2是否参与了H2S抑制心肌细胞凋亡作用。三、结果1、与NC组相比,mimic组Bcl-2的表达下降较明显,且与浓度密切相关,随着mimic浓度的增加而Bcl-2蛋白表达逐渐减少。与之相反,AMO-1组miR-1的含量较NC组明显降低；而Bcl-2的蛋白表达较NC组明显上升,且呈浓度梯度变化,随着AMO-1浓度的增加而增加。提示miR-1可以直接调控Bcl-2蛋白的表达。2、检测心肌细胞凋亡率,NC组与NC+H2S组比较无显著差异。与NC组相比,siRNA组细胞凋亡率有所增加；与HR+NC组相比,HR+siRNA组细胞凋亡率增加更为明显。提示转染Bcl-2 siRNA干扰片段可增加心肌细胞凋亡。与HR+NC+H2S组相比,HR+siRNA+H2S组的细胞凋亡率明显增加。提示转染siRNA下调Bcl-2表达后,给予H2S减少心肌细胞凋亡的作用被显著削弱。四、结论1、Bcl-2是miR-1的下游靶基因之一。2、Bcl-2参与了H2S抑制心肌细胞凋亡的过程,敲低其表达可以削弱H2S的部分保护作用。综上所述,H2S抑制IR损伤心肌细胞凋亡的过程至少部分是通过miR-1-Bcl-2信号通路实现的。
【关键词】：硫化氢 microRNA-1 心肌细胞 凋亡 缺血再灌注损伤
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-15
• 缩略词表15-17
• 前言17-20
• 研究背景17
• 实验假说17-18
• 研究目的18
• 实验设计18-20
• 第一部分 H_2S调节IR心肌细胞凋亡的在体实验研究20-52
• 材料与方法20-41
• 结果41-48
• 讨论48-51
• 小结51-52
• 第二部分 MiR-1参与H_2S影响心肌细胞凋亡的研究52-78
• 材料与方法52-66
• 结果66-75
• 讨论75-77
• 小结77-78
• 第三部分 H_2S调控miR-1—Bcl-2影响心肌细胞凋亡的实验研究78-91
• 材料与方法78-82
• 结果82-88
• 讨论88-90
• 小结90-91
• 全文总结91-92
• 综述92-98
• 参考文献98-105
• 攻读学位期间发表论文和参加科研工作105-108
• 致谢108-109

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本文编号：373447