自噬—溶酶体的转录调控在BRAF介导的黑色素瘤发生发展和耐药性中的功能研究

发布时间：2022-12-25 14:57

　　细胞自噬可以维持体内稳态平衡,在细胞的生长发育过程中起重要作用。细胞自噬与恶性黑色素瘤的发生和恶性转化密切相关。但目前的研究显示黑色素瘤发生发展和自噬之间的关系相互矛盾。一方面,自噬能抑制BRAFV600E驱动的肿瘤发生;另一方面,自噬能促进黑色素瘤的生长。这一悖论至今尚未解决,而且细胞自噬对黑色素瘤生长控制的具体分子机制并不清楚。BRAFV600E基因突变是黑色素瘤最常见的遗传改变。尽管BRAFV600E和自噬之间的关系一直模糊不清,但是BRAFV600E抑制剂（BRAFi）治疗的黑色素瘤患者体内细胞自噬水平显著增高。目前关于BRAFi诱导黑色素瘤产生自噬的几种可能的机制都不能很好地解释致癌BRAF信号传导与自噬之间的内在联系。因此,BRAFi诱导自噬的具体分子机制还需要进一步探究。另外,细胞自噬是黑色素瘤细胞产生耐药性的关键机制,自噬可能作为一种应激逃避机制导致耐药性的产生。但是目前关于黑色素瘤细胞产生耐药性的具体机制并不清楚。因此,本文旨在研究BRAFV600E黑色素瘤中BRAFi激活自噬-溶酶体的具体分子机制以及该途径对致癌信号传导和恶性肿瘤发生发展、转移以及耐药性的作用和影响... 

【文章页数】：224 页

【学位级别】：博士

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1 绪论
    1.1 国内外研究现状
        1.1.1 细胞自噬
        1.1.2 恶性黑色素瘤和BRAF
        1.1.3 转录因子EB(TFEB)与ZKSCAN3
    1.2 问题的提出和研究意义
    1.3 研究目的与研究内容
        1.3.1 研究目的
        1.3.2 研究内容
        1.3.3 技术路线
    1.4 创新性
2 抑制BRAF~(V600)E可以通过TFEB诱导自噬-溶酶体激活
    2.1 引言
    2.2 实验仪器、材料与试剂
        2.2.1 实验仪器
        2.2.2 实验材料与试剂
    2.3 实验方法
        2.3.1 细胞复苏、培养及冻存
        2.3.2 质粒的大量抽提
        2.3.3 质粒瞬时转染
        2.3.4 构建表达相应基因或shRNA的稳定细胞株
        2.3.5 自噬诱导分析
        2.3.6 实时定量PCR检测
        2.3.7 Western Blot检测目的蛋白表达
        2.3.8 免疫荧光染色
        2.3.9 GSEA基因富集分析
        2.3.10 β-N-乙酞氨基葡萄糖普酶(NAG)活性测定
        2.3.11 Lyso-tracker Red DND-99探针检测溶酶体
        2.3.12 数据处理
    2.4 实验结果
        2.4.1 PLX4720诱导细胞自噬
        2.4.2 PLX4720诱导细胞溶酶体功能激活
        2.4.3 PLX4720诱导细胞自噬以及溶酶体激活依赖于TFEB
    2.5 讨论
    2.6 本章小结
3 BRAF~(V600E)细胞中PLX4720通过抑制ERK来活化TFEB
    3.1 引言
    3.2 实验仪器、材料与试剂
        3.2.1 实验仪器
        3.2.2 实验材料与试剂
    3.3 实验方法
        3.3.1 细胞复苏、培养及冻存
        3.3.2 重组质粒构建
        3.3.3 质粒的大量抽提
        3.3.4 质粒瞬时转染
        3.3.5 构建表达相应基因或shRNA的稳定细胞株
        3.3.6 PLX4720或其他药物诱导
        3.3.7 Western Blot检测目的蛋白表达
        3.3.8 免疫荧光染色
        3.3.9 细胞核质分离
        3.3.10 蛋白免疫共沉淀
        3.3.11 GFP-Trap beads检测GFP蛋白
        3.3.12 数据处理
    3.4 实验结果
        3.4.1 PLX4720在BRAF~(V600E)细胞中诱导TFEB的细胞核易位
        3.4.2 PLX4720导致TFEB去磷酸化并失去与14-3-3蛋白的相互作用
        3.4.3 PLX4720通过抑制ERK激活TFEB
    3.5 讨论
    3.6 本章小结
4 ERK招募TFEB于溶酶体上直接磷酸化S142位点
    4.1 引言
    4.2 实验仪器、材料与试剂
        4.2.1 实验仪器
        4.2.2 实验材料与试剂
    4.3 实验方法
        4.3.1 细胞复苏、培养及冻存
        4.3.2 重组质粒构建
        4.3.3 定点基因突变质粒的构建
        4.3.4 质粒的大量抽提
        4.3.5 质粒瞬时转染
        4.3.6 构建表达相应基因或shRNA的稳定细胞株
        4.3.7 PLX4720或其他药物诱导
        4.3.8 Western Blot检测目的蛋白表达
        4.3.9 免疫荧光染色
        4.3.10 BL21感受态细胞的制作
        4.3.11 GST融合蛋白诱导表达及纯化
        4.3.12 蛋白激酶体外测定实验
        4.3.13 蛋白免疫共沉淀
        4.3.14 GFP-Trap beads检测GFP蛋白
        4.3.15 Lyso-tracker Red DND-99探针检测溶酶体
        4.3.16 数据处理
    4.4 实验结果
        4.4.1 在BRAF~(V600E)细胞中ERK与TFEB共定位于溶酶体
        4.4.2 BRAF~(V600E)细胞中ERK直接磷酸化TFEB Ser142介导其活性调控
        4.4.3 ERK介导的TFEB-溶酶体结合和S142磷酸化过程不依赖于mTORC1
        4.4.4 ERK介导S142磷酸化促进TFEB与14-3-3相互作用
        4.4.5 ERK介导的TFEB S142磷酸化构成了PLX4720诱导的黑色素瘤自噬-溶酶体激活的主要机制
    4.5 讨论
    4.6 本章小结
5 BRAFi通过JNK2/p38 MAPK磷酸化ZKSCAN3 Thr153介导其细胞质易位和失活来协同TFEB激活自噬-溶酶体
    5.1 引言
    5.2 实验仪器、材料与试剂
        5.2.1 实验仪器
        5.2.2 实验材料与试剂
    5.3 实验方法
        5.3.1 细胞复苏、培养及冻存
        5.3.2 重组质粒构建
        5.3.3 质粒的大量抽提
        5.3.4 质粒瞬时转染
        5.3.5 构建表达相应基因或shRNA的稳定细胞株
        5.3.6 PLX4720或其他药物诱导
        5.3.7 Western Blot检测目的蛋白表达
        5.3.8 免疫荧光染色
        5.3.9 细胞核质分离
        5.3.10 定点基因突变质粒的构建
        5.3.11 Lyso-tracker Red DND-99探针检测溶酶体
        5.3.12 数据处理
    5.4 实验结果
        5.4.1 在BRAF~(V600E)细胞中PLX4720诱导ZKSCAN3的细胞质易位
        5.4.2 PLX4720通过JNK2/p38 MAPK调控ZKSCAN3的细胞质易位
        5.4.3 JNK2/p38 MAPK磷酸化ZKSCAN3 T153调控其细胞质易位
        5.4.4 ZKSCAN3~(T153A) PLX4720诱导的自噬-溶酶体生物发生具有拮抗作用
    5.5 讨论
    5.6 本章小结
6 TFEB/ZKSCAN3介导的自噬-溶酶体转录抑制促进黑色素瘤恶化、侵袭和增殖
    6.1 引言
    6.2 实验仪器、材料与试剂
        6.2.1 实验仪器
        6.2.2 实验材料与试剂
    6.3 实验方法
        6.3.1 细胞复苏、培养及冻存
        6.3.2 重组质粒构建
        6.3.3 定点基因突变质粒的构建
        6.3.4 质粒的大量抽提
        6.3.5 质粒瞬时转染
        6.3.6 构建表达相应基因或shRNA的稳定细胞株
        6.3.7 逆转录病毒包装和稳定株的构建
        6.3.8 Western Blot检测目的蛋白表达
        6.3.9 NOD/SCID小鼠实验
        6.3.10 细胞集落形成实验
        6.3.11 扫描电子显微镜分析
        6.3.12 免疫组织化学分析
        6.3.13 数据处理
    6.4 实验结果
        6.4.1 TFEB介导的自噬-溶酶体激活能抑制BRAF~(V600E)驱动的黑色素瘤发生发展
        6.4.2 TFEB S142磷酸化介导的自噬-溶酶体转录抑制有助于肿瘤恶化、侵袭和增殖
        6.4.3 ZKCAN3的沉默与TFEB表达协同抑制BRAF~(V600E)驱动的黑色素瘤发生发展
    6.5 讨论
    6.6 本章小结
7 TFEB S142磷酸化介导的自噬-溶酶体失活通过抑制TGF-β蛋白降解来激活TGF-β和EMT信号传导
    7.1 引言
    7.2 实验仪器、材料与试剂
        7.2.1 实验仪器
        7.2.2 实验材料与试剂
    7.3 实验方法
        7.3.1 细胞复苏、培养及冻存
        7.3.2 重组质粒构建
        7.3.3 定点基因突变质粒的构建
        7.3.4 质粒的大量抽提
        7.3.5 质粒瞬时转染
        7.3.6 构建表达相应基因或shRNA的稳定细胞株
        7.3.7 实时定量PCR检测
        7.3.8 Western Blot检测目的蛋白表达
        7.3.9 免疫荧光染色
        7.3.10 蛋白免疫共沉淀
        7.3.11 BL21感受态细胞的制作
        7.3.12 融合蛋白诱导表达及纯化
        7.3.13 蛋白体外相互作用测定实验
        7.3.14 Pulldown检测蛋白相互作用
        7.3.15 高通量RNA测序(RNA-seq)
        7.3.16 GSEA基因富集分析
        7.3.17 药物诱导
        7.3.18 数据处理
    7.4 实验结果
        7.4.1 TFEB S142磷酸化和由此产生的自噬-溶酶体转录抑制降低肿瘤分化
        7.4.2 TFEB S142磷酸化促进TGF-β信号传导的活化和EMT的激活
        7.4.3 TFEB S142磷酸化引起的自噬-溶酶体失活抑制TGF-β蛋白降解
        7.4.4 自噬蛋白LC3与pro-TGF-β直接相互作用调控TGF-β蛋白降解
    7.5 讨论
    7.6 本章小结
8 TFEB S142磷酸化促进BRAF~(V600E)黑色素瘤的肺转移
    8.1 引言
    8.2 实验仪器、材料与试剂
        8.2.1 实验仪器
        8.2.2 实验材料与试剂
    8.3 实验方法
        8.3.1 细胞复苏、培养及冻存
        8.3.2 重组质粒构建
        8.3.3 定点基因突变质粒的构建
        8.3.4 质粒的大量抽提
        8.3.5 质粒瞬时转染
        8.3.6 构建表达相应基因或shRNA的稳定细胞株
        8.3.7 逆转录病毒包装和稳定株的构建
        8.3.8 Western Blot检测目的蛋白表达
        8.3.9 C57B1/6J小鼠实验
        8.3.10 免疫荧光染色
        8.3.11 Lyso-tracker Red DND-99探针检测溶酶体
        8.3.12 免疫组织化学分析
        8.3.13 数据处理
    8.4 实验结果
        8.4.1 TFEB S142磷酸化对表达BRAF~(V600E)的B16-F10黑色素瘤细胞中自噬和溶酶体生物发生具有抑制作用
        8.4.2 TFEB S142磷酸化促进BRAF~(V600E)黑色素瘤的肺转移
    8.5 讨论
    8.6 本章小结
9 TFEB S142磷酸化介导的自噬-溶酶体失活在耐药性BRAF~(V600E)黑色素瘤中促进肿瘤恶化、侵袭和增殖
    9.1 引言
    9.2 实验仪器、材料与试剂
        9.2.1 实验仪器
        9.2.2 实验材料与试剂
    9.3 实验方法
        9.3.1 细胞复苏、培养及冻存
        9.3.2 重组质粒构建
        9.3.3 定点基因突变质粒的构建
        9.3.4 质粒的大量抽提
        9.3.5 质粒瞬时转染
        9.3.6 构建表达相应基因或shRNA的稳定细胞株
        9.3.7 细胞集落形成实验
        9.3.8 Western Blot检测目的蛋白表达
        9.3.9 NOD/SCID小鼠实验
        9.3.10 免疫荧光染色
        9.3.11 药物诱导
        9.3.12 免疫组织化学分析
        9.3.13 数据处理
    9.4 实验结果
        9.4.1 A375~R细胞对PLX4720不敏感
        9.4.2 TFEB S142磷酸化在BRAFi不敏感的BRAF~(V600E)黑色素瘤中促进肿瘤发生发展
    9.5 讨论
    9.6 本章小结
10 TFEB S142磷酸化介导的自噬-溶酶体抑制赋予黑色素瘤耐药性并促进TGF-β和EMT信号传导和肿瘤肉瘤样变
    10.1 引言
    10.2 实验仪器、材料与试剂
        10.2.1 实验仪器
        10.2.2 实验材料与试剂
    10.3 实验方法
        10.3.1 细胞复苏、培养及冻存
        10.3.2 重组质粒构建
        10.3.3 定点基因突变质粒的构建
        10.3.4 质粒的大量抽提
        10.3.5 质粒瞬时转染
        10.3.6 构建表达相应基因或shRNA的稳定细胞株
        10.3.7 逆转录病毒包装和稳定株的构建
        10.3.8 细胞集落形成实验
        10.3.9 Western Blot检测目的蛋白表达
        10.3.10 NOD/SCID小鼠实验
        10.3.11 免疫荧光染色
        10.3.12 药物诱导
        10.3.13 免疫组织化学分析
        10.3.14 数据处理
    10.4 实验结果
        10.4.1 TFEB S142磷酸化赋予黑色素瘤细胞对BRAFi的耐药性
        10.4.2 TFEB S142磷酸化抑制了PLX4720对黑色素瘤的治疗效果
        10.4.3 TFEB S142磷酸化促进原发性肿瘤和转移瘤中TGF-β和EMT信号传导水平并同时抑制肿瘤分化引起肉瘤样变
        10.4.4 TGF-β受体抑制剂(TGF-βRi)与BRAFi协同作用使表达TFEB~(S142E)的细胞对BRAFi重新敏感
    10.5 讨论
    10.6 本章小结
11 总结与展望
    11.1 总结
    11.2 工作展望
参考文献
附录A 作者在攻读博士学位期间发表论文及申请专利情况
附录B
    A. 本文中RNA-seq及GSEA分析原始结果
    B. 学位论文数据集
致谢



本文编号：3726832