N-乙酰乳糖胺表达升高及其对胃癌发展的作用机制研究

发布时间：2023-02-09 18:14

　　研究目的:在我国,胃癌是一种高发病率的恶性肿瘤严重危害人民健康。蛋白质的糖基化修饰是一种重要的翻译后修饰,在肿瘤的发展和转移过程中均伴有蛋白质异常糖基化修饰的产生。然而异常的糖基化修饰在肿瘤进程中的作用有待进一步阐明。因此,本研究以胃癌细胞及不同分期胃癌患者组织为研究对象,筛选与胃癌相关的异常糖基化修饰,解析糖链结构,分析异常糖基化的合成通路以及其对胃癌细胞侵袭和转移等生物学行为的影响,本研究将为阐明异常糖基化修饰在胃癌发展中的作用机制提供帮助。方法:1.利用凝集素芯片分析胃癌细胞/胃癌组织的糖蛋白糖链谱,筛选与胃癌相关的异常糖蛋白糖链,随后通过凝集素组织化学以及凝集素细胞化学方法在细胞水平上验证筛选的异常糖蛋白糖链;2.构建朝鲜槐凝集素(Maackia amurensis I,MAL-I)-磁性微粒复合物,分别从胃癌细胞/胃癌组织蛋白中分离MAL-I特异性识别的糖蛋白并释放糖链,借助基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术解析N-聚糖结构,比较分析胃癌...

【文章页数】：179 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语对照表
第一章 绪论
    1.1 胃癌
        1.1.1 胃癌的流行病调查
        1.1.2 胃癌分类与分型
        1.1.3 胃癌的形成原因
            1.1.3.1 幽门螺旋杆菌与胃癌
            1.1.3.2 胃癌患者遗传因素
    1.2 糖组学
        1.2.1 糖组学概念
        1.2.2 糖与蛋白质糖基化
        1.2.3 肿瘤发展过程中蛋白质的异常糖基化
        1.2.4 乳糖胺的合成及其生物学功能
    1.3 胃癌相关蛋白质异常糖基化研究现状
        1.3.1 胃癌发展过程中异常表达的糖基转移酶
        1.3.2 胃癌发展过程中结构发生改变的糖蛋白糖链
    1.4 本研究目的意义与技术路线
第二章 胃癌细胞糖蛋白糖链谱研究
    2.1 引言
    2.2 实验材料
        2.2.1 实验主要仪器
        2.2.2 实验试剂及耗材
        2.2.3 实验溶液配制方法
        2.2.4 数据采集及分析软件
    2.3 实验方法
        2.3.1 胃癌及正常细胞培养
        2.3.2 细胞总蛋白提取
        2.3.3 环氧化修饰片基的准备
        2.3.4 凝集素芯片的点制
        2.3.5 细胞蛋白荧光标记与孵育
        2.3.6 芯片数据处理
        2.3.7 凝集素细胞化学
    2.4 实验结果
        2.4.1 胃癌及正常细胞糖蛋白糖链谱分析
        2.4.2 凝集素组化验证
    2.5 本章小结与讨论
第三章 不同分期胃癌组织糖蛋白糖链谱研究
    3.1 引言
    3.2 实验材料
        3.2.1 实验主要仪器
        3.2.2 实验试剂及耗材
        3.2.3 实验溶液配制方法
        3.2.4 数据采集及分析软件
    3.3 实验方法
        3.3.1 胃癌组织及癌旁组织样本收集及临床信息整理
        3.3.2 组织总蛋白提取
        3.3.3 凝集素芯片制备及数据处理
        3.3.4 凝集素组化验证
    3.4 实验结果
        3.4.1 胃癌与癌旁组织糖蛋白糖链谱比较分析
        3.4.2 凝集素组化验证
    3.5 本章小结与讨论
第四章 胃癌细胞及胃癌组织中含LacNAc结构N-聚糖的分离及鉴定
    4.1 引言
    4.2 实验材料
        4.2.1 实验主要仪器
        4.2.2 实验试剂及耗材
        4.2.3 实验溶液配制方法
        4.2.4 数据采集及分析软件
    4.3 实验方法
        4.3.1 凝集素磁性微粒复合物制备
        4.3.2 糖蛋白的分离纯化
        4.3.3 糖蛋白PNGase F酶解
        4.3.4 N-聚糖脱盐纯化
        4.3.5 N-聚糖质谱解析
        4.3.6 质谱数据分析
    4.4 实验结果
        4.4.1 胃癌细胞MAL-I分离糖蛋白N-聚糖质谱解析结果
        4.4.2 胃癌组织MAL-I分离糖蛋白N-聚糖质谱鉴定结果
    4.5 本章小结与讨论
第五章 胃癌相关异常糖蛋白糖链的合成通路研究
    5.1 引言
    5.2 实验材料
        5.2.1 实验主要仪器
        5.2.2 实验试剂及耗材
        5.2.3 实验溶液配制方法
        5.2.4 数据采集及分析软件
    5.3 实验方法
        5.3.0 胃癌组织RNA提取
        5.3.1 糖相关基因芯片制备
        5.3.2 糖相关基因芯片靶标制备
        5.3.3 糖相关基因芯片杂交及数据分析
        5.3.4 Real-Time PCR验证
        5.3.5 免疫印迹分析
    5.4 实验结果
        5.4.1 不同分期胃癌组织糖相关基因表达分析
        5.4.2 RT-PCR验证
        5.4.3 差异表达糖相关基因代谢通路
        5.4.4 差异表达糖相关基因功能分析
        5.4.5 B4GALT3 表达升高与LacNAc的异常积累相关
        5.4.6 结合数据库分析B4GALT3 在胃癌中的表达水平
    5.5 本章小结与讨论
第六章 糖基转移酶B4GALT3 表达对胃癌细胞的影响
    6.1 引言
    6.2 实验材料
        6.2.1 实验主要仪器
        6.2.2 实验试剂及耗材
        6.2.3 实验溶液配制方法
        6.2.4 数据采集及分析软件
    6.3 实验方法
        6.3.1 B4GALT3 干扰及过表达慢病毒质粒
        6.3.2 质粒扩增与提取
        6.3.3 慢病毒包装与浓缩
        6.3.4 测量病毒滴度
        6.3.5 慢病毒转染
        6.3.6 稳转细胞筛选
        6.3.7 免疫印迹分析干扰及过表达效果
        6.3.8 凝集素芯片分析B4GALT3 表达对MAL-I识别的LacNAc的影响
        6.3.9 B4GALT3 表达对SGC-7901 增殖能力的影响
        6.3.10 B4GALT3 表达对SGC-7901 迁移及侵袭能力的影响
        6.3.11 B4GALT3 表达对SGC-7901 克隆形成能力的影响
    6.4 实验结果
        6.4.1 转染效果鉴定
        6.4.2 B4GALT3 表达影响胃癌细胞LacNAc合成
        6.4.3 B4GALT3 表达不影响SGC-7901 增殖能力
        6.4.4 B4GALT3 促进SGC-7901 迁移能力
        6.4.5 B4GALT3 促进SGC-7901 侵袭能力
        6.4.6 B4GALT3 促进SGC-7901 克隆形成能力
    6.5 本章小结与讨论
全文总结与展望
参考文献
附录
致谢
攻读博士学位期间取得科研成果
作者简介



本文编号：3739015