基于ZapLck FRET生物探针技术探究Lck动态激活的生物物理学机制
发布时间：2023-02-19 13:35
淋巴细胞特异性酪氨酸蛋白激酶(Lck)在T细胞受体(TCR)信号通路启动过程中起着非常重要的作用。在经典的TCR信号转导通路中,当TCR与配体结合而被激活时,最先被检测到的分子事件即是激活的Lck磷酸化CD3-ζ链中的ITAM基序上的酪氨酸残基。磷酸化的ITAM作为停泊位点招募Zap70激酶,随后招募至此的Zap70激酶因被激活的Lck磷酸化而激活,参与TCR信号的转导过程。但是,在这一信号转导过程中,Lck蛋白激酶的动态激活调节机制还没有得到很好的研究。Lck激酶活性的调节与其酪氨酸394和酪氨酸505残基的磷酸化水平密切相关。通常认为酪氨酸505的磷酸化抑制了Lck的激酶活性,它的突变会造成Lck的持续激活。而酪氨酸394的磷酸化促进了Lck的激酶活性,它的突变则会导致Lck激酶活性丧失,但是也有一些研究小组持有不同的看法。可见,酪氨酸394残基在调节Lck激酶活性中的功能作用是有争议的。而且先前的研究报道对Lck激酶预激活状态的存在也有争议。通常用于研究Lck激酶活性调节的方法为生物化学方法,如Western Blot,这种经典方法并不能有效地监测活细胞中Lck激酶活性的动态变化...
【文章页数】：148 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
主要缩略词
1 绪论
1.1 问题的提出与意义
1.2 国内外研究现状
1.2.1 TCR信号转导中分子事件的研究现状
1.2.2 Lck结构和功能的研究现状
1.2.3 荧光共振转移原理在生物学研究中的应用
1.3 研究目的以及研究内容
1.3.1 研究目的
1.3.2 研究内容
2 新型LckFRET生物探针的构建以及体外表征
2.1 前言
2.2 实验仪器、材料与试剂
2.2.1 实验仪器
2.2.2 实验材料与试剂
2.2.3 配制的溶液和试剂
2.3 实验方法
2.3.1 重组LckFRET生物探针质粒和Src FRET生物探针质粒的扩增
2.3.2 LckFRET生物探针蛋白和Src FRET生物探针蛋白的诱导表达
2.3.3 纯化LckFRET生物探针蛋白和Src FRET生物探针蛋白
2.3.4 体外激酶分析法
2.4 实验结果
2.4.1 LckFRET生物探针蛋白的诱导表达和纯化
2.4.2 LckFRET生物探针在体外对激活的Src激酶的灵敏性
2.4.3 Lck生物探针的FRET信号变化与探针分子空间构象变化的关系
2.5 讨论
2.6 本章小结
3 LckFRET生物探针的特异性底物肽的筛选
3.1 前言
3.2 实验仪器、材料和试剂
3.2.1 实验仪器
3.2.2 实验材料与试剂
3.3 实验方法
3.3.1 Jurkat细胞培养
3.3.2 293T细胞的培养
3.3.3 pSIN-Zap Lck、pSIN-LckWT、pSIN-LckY394F和pSIN-LckK273R重组质粒的构建
3.3.4 慢病毒包装
3.3.5 慢病毒收集
3.3.6 慢病毒转染细胞
3.3.7 电转染(Electroporation)
3.3.8 CD3/CD28抗体复合物的配制
3.3.9 活细胞成像实验
3.3.10 IP/IB(免疫沉淀和免疫印迹)
3.4 结果
3.4.1 重组质粒pSIN-Zap Lck、pSIN-LckWT、pSIN-LckY394F和pSIN-LckK273R的构建
3.4.2 Jurkat细胞中Lck-FRET-Zap70FY生物探针对Lck激酶活性的监测
3.4.3 Lck-FRET-Zap70FY生物探针对Lck激酶活性监测的特异性
3.4.4 T细胞中LckY394F激酶活性检测
3.4.5 内源性Zap70对Zap Lck生物探针底物肽磷酸化的影响
3.4.6 Fyn FRET生物探针对T细胞中Fyn激酶的活性监测
3.5 本章讨论
3.6 本章小结
4 Lck激酶在T细胞中的预先激活评估
4.1 前言
4.2 实验仪器、材料与试剂
4.2.1 实验仪器
4.2.2 实验材料与试剂
4.3 实验方法
4.3.1 PBMC细胞分离与培养
4.3.2 重组质粒pSIN-LckWT-mCherry和pSIN-LckY394F-mCherry的构建
4.4 实验结果
4.4.1 Jurkat细胞中内源性LckWT激酶的预先激活评估
4.4.2 PBMC细胞中Lck激酶预先激活部分的评估
4.4.3 重组质粒pSIN-LckWT-mCherry和pSIN-LckY394F-mCherry的构建
4.4.4 LckWT和LckY394F在T细胞中的分布
4.5 本章讨论
4.6 本章小结
5 Lck激酶介导ERK激酶的快速激活
5.1 前言
5.2 实验仪器、材料与试剂
5.2.1 实验仪器
5.2.2 实验材料与试剂
5.3 实验方法
5.3.1 pcDNA3.1-ERK FRET生物探针质粒的扩增
5.3.2 Western Blot
5.3.3 活细胞成像实验
5.4 实验结果
5.4.1 LckY394F转导TCR信号至下游分子ERK
5.4.2 ERK蛋白水平的磷酸化
5.4.3 PP1预处理对LckY394F介导的ERK激酶的快速激活的影响
5.5 讨论
5.6 本章小结
6 T细胞共受体CD3和CD28在Lck激活中的重要作用
6.1 前言
6.2 实验仪器、材料与试剂
6.2.1 实验仪器
6.2.2 实验材料与试剂
6.3 实验方法
6.3.1 抗体复合物的配制
6.3.2 活细胞成像实验
6.4 实验结果
6.4.1 不同浓度CD3/CD28抗体复合物刺激对Lck激酶激活的影响
6.4.2 不同浓度CD3受体-抗体结合对Lck激酶激活的影响
6.4.3 CD28受体-抗体结合对Lck激酶激活的影响
6.5 本章讨论
6.6 本章小结
7 LckWT和LckY394F表达水平与其激酶活性之间的关系
7.1 前言
7.2 实验仪器、材料与试剂
7.2.1 实验仪器
7.2.2 实验材料与试剂
7.3 实验方法
7.3.1 重组质粒的构建
7.3.2 慢病毒包装
7.3.3 抗体复合物的配制
7.3.4 活细胞成像实验
7.4 实验结果
7.4.1 重组质粒pSIN-LckK273R-mCherry的构建
7.4.2 Lck表达水平与其基础活性之间的关系
7.4.3 Lck表达水平对其激酶激活动力学的影响
7.5 本章讨论
7.6 本章小结
8 LckWT和LckY394F不同的激酶调节模式
8.1 前言
8.2 实验仪器、材料与试剂
8.2.1 实验仪器
8.2.2 实验材料与试剂
8.3 实验方法
8.3.1 重组质粒的构建
8.3.2 荧光漂白与恢复实验
8.3.3 BiFC-splitVenus体系活细胞成像实验
8.4 实验结果
8.4.1 Lck在T细胞中的扩散速率
8.4.2 Lck-Bi FC-split-Venus体系相关重组质粒的构建
8.4.3 细胞中Lck激酶分子间的相互作用
8.5 本章讨论
8.6 本章小结
9 结论、不足与展望
9.1 主要结论
9.2 工作不足之处
9.3 工作展望
参考文献
附录
A 作者在攻读博士学位期间发表论文及专利情况
论文
专利
B 学位论文数据集
致谢
本文编号：3746321
【文章页数】：148 页
【学位级别】：博士
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中文摘要
英文摘要
主要缩略词
1 绪论
1.1 问题的提出与意义
1.2 国内外研究现状
1.2.1 TCR信号转导中分子事件的研究现状
1.2.2 Lck结构和功能的研究现状
1.2.3 荧光共振转移原理在生物学研究中的应用
1.3 研究目的以及研究内容
1.3.1 研究目的
1.3.2 研究内容
2 新型LckFRET生物探针的构建以及体外表征
2.1 前言
2.2 实验仪器、材料与试剂
2.2.1 实验仪器
2.2.2 实验材料与试剂
2.2.3 配制的溶液和试剂
2.3 实验方法
2.3.1 重组LckFRET生物探针质粒和Src FRET生物探针质粒的扩增
2.3.2 LckFRET生物探针蛋白和Src FRET生物探针蛋白的诱导表达
2.3.3 纯化LckFRET生物探针蛋白和Src FRET生物探针蛋白
2.3.4 体外激酶分析法
2.4 实验结果
2.4.1 LckFRET生物探针蛋白的诱导表达和纯化
2.4.2 LckFRET生物探针在体外对激活的Src激酶的灵敏性
2.4.3 Lck生物探针的FRET信号变化与探针分子空间构象变化的关系
2.5 讨论
2.6 本章小结
3 LckFRET生物探针的特异性底物肽的筛选
3.1 前言
3.2 实验仪器、材料和试剂
3.2.1 实验仪器
3.2.2 实验材料与试剂
3.3 实验方法
3.3.1 Jurkat细胞培养
3.3.2 293T细胞的培养
3.3.3 pSIN-Zap Lck、pSIN-LckWT、pSIN-LckY394F和pSIN-LckK273R重组质粒的构建
3.3.4 慢病毒包装
3.3.5 慢病毒收集
3.3.6 慢病毒转染细胞
3.3.7 电转染(Electroporation)
3.3.8 CD3/CD28抗体复合物的配制
3.3.9 活细胞成像实验
3.3.10 IP/IB(免疫沉淀和免疫印迹)
3.4 结果
3.4.1 重组质粒pSIN-Zap Lck、pSIN-LckWT、pSIN-LckY394F和pSIN-LckK273R的构建
3.4.2 Jurkat细胞中Lck-FRET-Zap70FY生物探针对Lck激酶活性的监测
3.4.3 Lck-FRET-Zap70FY生物探针对Lck激酶活性监测的特异性
3.4.4 T细胞中LckY394F激酶活性检测
3.4.5 内源性Zap70对Zap Lck生物探针底物肽磷酸化的影响
3.4.6 Fyn FRET生物探针对T细胞中Fyn激酶的活性监测
3.5 本章讨论
3.6 本章小结
4 Lck激酶在T细胞中的预先激活评估
4.1 前言
4.2 实验仪器、材料与试剂
4.2.1 实验仪器
4.2.2 实验材料与试剂
4.3 实验方法
4.3.1 PBMC细胞分离与培养
4.3.2 重组质粒pSIN-LckWT-mCherry和pSIN-LckY394F-mCherry的构建
4.4 实验结果
4.4.1 Jurkat细胞中内源性LckWT激酶的预先激活评估
4.4.2 PBMC细胞中Lck激酶预先激活部分的评估
4.4.3 重组质粒pSIN-LckWT-mCherry和pSIN-LckY394F-mCherry的构建
4.4.4 LckWT和LckY394F在T细胞中的分布
4.5 本章讨论
4.6 本章小结
5 Lck激酶介导ERK激酶的快速激活
5.1 前言
5.2 实验仪器、材料与试剂
5.2.1 实验仪器
5.2.2 实验材料与试剂
5.3 实验方法
5.3.1 pcDNA3.1-ERK FRET生物探针质粒的扩增
5.3.2 Western Blot
5.3.3 活细胞成像实验
5.4 实验结果
5.4.1 LckY394F转导TCR信号至下游分子ERK
5.4.2 ERK蛋白水平的磷酸化
5.4.3 PP1预处理对LckY394F介导的ERK激酶的快速激活的影响
5.5 讨论
5.6 本章小结
6 T细胞共受体CD3和CD28在Lck激活中的重要作用
6.1 前言
6.2 实验仪器、材料与试剂
6.2.1 实验仪器
6.2.2 实验材料与试剂
6.3 实验方法
6.3.1 抗体复合物的配制
6.3.2 活细胞成像实验
6.4 实验结果
6.4.1 不同浓度CD3/CD28抗体复合物刺激对Lck激酶激活的影响
6.4.2 不同浓度CD3受体-抗体结合对Lck激酶激活的影响
6.4.3 CD28受体-抗体结合对Lck激酶激活的影响
6.5 本章讨论
6.6 本章小结
7 LckWT和LckY394F表达水平与其激酶活性之间的关系
7.1 前言
7.2 实验仪器、材料与试剂
7.2.1 实验仪器
7.2.2 实验材料与试剂
7.3 实验方法
7.3.1 重组质粒的构建
7.3.2 慢病毒包装
7.3.3 抗体复合物的配制
7.3.4 活细胞成像实验
7.4 实验结果
7.4.1 重组质粒pSIN-LckK273R-mCherry的构建
7.4.2 Lck表达水平与其基础活性之间的关系
7.4.3 Lck表达水平对其激酶激活动力学的影响
7.5 本章讨论
7.6 本章小结
8 LckWT和LckY394F不同的激酶调节模式
8.1 前言
8.2 实验仪器、材料与试剂
8.2.1 实验仪器
8.2.2 实验材料与试剂
8.3 实验方法
8.3.1 重组质粒的构建
8.3.2 荧光漂白与恢复实验
8.3.3 BiFC-splitVenus体系活细胞成像实验
8.4 实验结果
8.4.1 Lck在T细胞中的扩散速率
8.4.2 Lck-Bi FC-split-Venus体系相关重组质粒的构建
8.4.3 细胞中Lck激酶分子间的相互作用
8.5 本章讨论
8.6 本章小结
9 结论、不足与展望
9.1 主要结论
9.2 工作不足之处
9.3 工作展望
参考文献
附录
A 作者在攻读博士学位期间发表论文及专利情况
论文
专利
B 学位论文数据集
致谢
本文编号：3746321
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/yxlbs/3746321.html
